桦褐孔菌中小分子酚醛类物质的抗氧化活性

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1、桦褐孔菌中的小分子酚醛类物质的抗氧化活性摘要桦褐孔菌是一种药用真菌，他在俄罗斯的民间药方中具有广泛的应用，并且据说对人体的健康具有很多益处，比如说桦褐孔菌具有免疫调节和抗肿瘤活性。在本研究中，我们将桦褐孔菌的水提取物与其他几种药用真菌（姬松茸，灵芝和桑子菇）的水提取物的抗氧化作用进行了精确地对比，结果发现桦褐孔菌具有最强的过氧化物和羟自由基的清除能力。然后我们将桦褐孔菌的子实体与菌核分开，分别用80%的甲醇进行提取，结果显示桦褐孔菌子实体的抗氧化能力要远远高于菌核。最后，我们从桦褐孔菌子实体80%甲醇提取物中分离出了7种抗氧化成分，经过鉴定他们是以下几种小分子的酚醛

2、类物质：4-羟基-3，5-二甲氧基苯甲酸乙酯2-羟基-1-羟甲基酯(丁香酸乙酯-2羟基-1-羟甲基酯，BAEE)，原儿茶酸（PCA），咖啡酸（CA），原儿茶醛（DB），2,5-二羟基对苯二甲酸（DTA），丁香酸（SA）和3，4-二羟基苯丁烯（DBL)。值得注意的是，BAEE是第一次从天然产物中分离并鉴定出来。桦褐孔菌是一种分布于欧洲高纬度地区，朝鲜和日本的真菌，它通常寄生在白桦树的树枝上，一些黑色的，不成形的桦褐孔菌可以在树干上寄生10--15年，不过大部分的桦褐孔菌还是生长在白桦树的树枝上，也被称为白桦茸，已经被应用于传统的药方之中。近几年好多文献报道桦褐孔菌具有

3、提升健康的作用，例如，保护DNA免受氧化应激的伤害，抗炎，止疼，抗肿瘤活性等。然而，除了一些萜类物质外，迄今为止还没有文献报道桦褐孔菌水提取物中活性成分的化学结构。另一方面，众所周知，氧化应激反应会造成各种各样的疾病，如癌症，高血压，神经性疾病（阿尔茨海默氏症和帕金森氏症），以及一些自身免疫疾病。因此许多来源于食物等天然产物中的抗氧化性物质被用来治疗疾病。在这些文献中，提到最多的就是白桦茸的抗氧化特性，尽管由文献报道说桦褐孔菌中的多酚片段具有抗氧化活性，但是这些物质抗氧化的原理仍然少有报道。桦褐孔菌由两部分组成：黑色部分（大部分在外部）和褐色部分（大部分在内部），通

4、常他们被称为菌核（ST）和子实体（FB），然而，在日本，大部分的桦褐孔菌产品都没有把这两部分分开。在本研究中，我们先将桦褐孔菌热水提取物的抗氧化能力与其他的药用真菌热水提取物的抗氧化能力进行了对比，然后将桦褐孔菌的黑色部分和褐色部分的热水提取物的抗氧化能力进行了对比，已确定它们各自所含有的抗氧化物质。实验步骤桦褐孔菌热水提取物的制备分别将将1g桦褐孔菌，姬松茸，灵芝和桑子菇置于10ml热水中并煮沸1h，冷却至室温，并加水至10ml，3400rpm离心10min，上清液保存在-20℃的冰箱中备用。桦褐孔菌菌丝体和子实体提取物的制备取桦褐孔菌子实体和菌核粉末各1g，分别

5、将它们置于10ml的水中或不同浓度的甲醇水溶液中（20%，50%，80%的甲醇），室温过夜，3400rpm离心10min，取上清液保存在-20℃的冰箱中备用。桦褐孔菌中抗氧化物质的分离与鉴定活性物质纯化的步骤概述见表1，桦褐孔菌子实体粉末（干重320g）用80%的甲醇在室温下提取，甲醇提取物在室温条件下减压干燥，共得甲醇提取物（22.8g），然后将其溶于乙酸乙酯与水的混合液中，结果分散于水相的有10.2g（1-b），分散于乙酸乙酯中的有12.6g（1-a），把1-a溶液过一下HP-20甲醛系树脂柱，然后逐步洗脱，共得到五种成分（2-a-e），30%甲醇洗脱的为2-a

6、，50%甲醇洗脱的为2-b，75%甲醇洗脱的为2-c，100%甲醇洗脱的为2-d，乙酸乙酯洗脱的为2-e，收集的2-a，2-b两种成分再利用HPLC做进一步的分离，（C-18反相制备柱，流动相为4%的乙腈，含有0.01%的TFA），得到了如下几种成分：化合物A,9mg；化合物B，20mg；化合物C,11mg，化合物G，11mg；用12%的乙腈洗脱得到了化合物D4mg和化合物E10mg，用12%的乙腈萃取2-b成分得到了化合物F53mg，纯化后的组分的化学结构通过NMR和MS来测定。化合物B，C，D，E，F，G的评估通过HPLC来进一步的制备，并按照商业应用的各自可行

7、的标准来进行，下面给出的NMR数据只是从天然产物中提取的化合物A的数据。通过ESR（电子自旋共振）来测定抗氧化活性根据文献报道的方法，将真菌的水提取物加入到反应体系中，以测定桦褐孔菌清除DPPH的能力。反应体系中的UV-H2O2系统会产生羟自由基。整个反应体系包括100ul的样品溶液，80ul150mmol/l的DMPO，120ul50mmol/l的H2O2，总体积为300ul，将混合液装入试管中，用254nm的紫外线照射5min，紫外照射完成1min后，通过ESR测定体系中的DMPO-OH信号。超氧阴离子自由基清除能力的测定根据文献报道来进行。次黄嘌呤/黄嘌呤