western blot 法检测大鼠肝组织血清蛋白的表达变化

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1、Western-blot一、实验目的1、用于目的蛋白的表达特性分析2、目的蛋白与其他蛋白的相互作用二、实验原理在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测的一项技术。与SouthernBlot或NorthernBlot杂交方法类似，但WesternBlot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生

2、物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。WesternBlot显色的方法主要有以下几种：i.放射自显影ii.底物化学发光ECLiii.底物荧光ECFiv.底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为

3、过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。三、实验器材及试剂1、器材：（1）可调移液器P1000、P200和P20，经消毒的相应的盒装吸头（2）经消毒的1.5mlEppendorf管、试管架及水浴锅用试管架（3）定时器，记号笔，一次性口罩和筒纸（4）于冷室中预冷的1.4万转台式离心机（5）PH试纸（6）分光光度仪，石英比色杯（7）烧杯，量筒，棕色试剂瓶（8）0.45um滤纸2、主要试剂(1)一抗：小鼠抗大鼠多克隆抗体（清蛋白，分子量66kD）(2)二抗：羊抗小鼠IgG-HRP(3)定蛋白试剂盒：南京建成生物工程研

4、究所。(4)四甲基乙二胺（TEMED）:Sigma分装。（5）RIPA(100ml):NaCl0.88g，NP-401ml，10%SDS1ml，1MTris（PH7.2）5ml，0.5,MEDTA(PH8.0)1ml,加去离子水至100ml。（6）Completemini液：每片药片加去离子水1ml溶液。（7）0.1MPMSF5ml：称取PMSF87mg，用异丙醇溶解，使终体积为5ml。(8)2MTris（100ml，PH6.8）:Tris24.23g,用HCl调PH至6.8，终体积为100ml。（9）3MTris（100ml，PH8.8

5、）：Tris36.34g,用HCl调PH至8.8，终体积为100ml。（10）10%SDS（50ml）：SDS5g，去离子水溶解至50ml。四、实验步骤（一）组织匀浆的制备1、称取大鼠肝组织100mg,放入8ml离心管中，加入RIPA900μl,冰浴匀浆（超声）。52、匀浆后立即加入PMSF100μl,转移至1.5ml离心管中。加入Complete液40μl，4℃离心，10000rpm，10分钟，收集上清液。3、4℃，10000rpm再次离心10min。上清液分装，-70℃保存（也可不过夜）。另取少量上清液测蛋白含量。（二）蛋白含量的测定

6、及上样量的计算（考马斯亮蓝法）原理：考马斯亮蓝（CoomassieBrilliantBlue）法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰（lmax）的位置，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。1、样品的稀释样品采用25倍稀释，即2ul的样品中加双蒸水48ul即可（具体要根据样品的浓度适当稀释）2、显色剂（

7、试剂盒附带说明）的稀释将贮备液1：4稀释3、操作空白管标准管测定管蒸馏水（ml）0.050.563mg/ml标准蛋白（ml）0.05样品（ml）0.05显色剂（ml）3.03.03.0混匀，静置10min，于595nm处，以空白管调零，测定各管吸光度。4、计算蛋白含量(g/L)＝测定管吸光度/标准管吸光度×标准管浓度(g/L)根据所求样品的实际蛋白含量，求得在20μl总体积中的样品体积，保证每个样品的上样量为120μg。二、Westernblot法检测肝脏清蛋白的表达（一）样品的处理（1）将分装好的样品从冰箱中取出，用RIPA进行稀释。（

8、2）16μl稀释液中加入上样缓冲液4μl，混匀。（3）95℃水浴中煮5分钟，冷却后可上样。以上步骤均由老师代为完成，本实验学生实验部分从下面开始。写出未实验部分，为了熟悉整个Western-b