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《用单个特异引物扩增桃ACC氧化酶cDNA及其在大肠杆菌中的表达》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、应用与环境生物学报1999,5(1):55～59Chin.J.Appl.Environ.Biol.1999202225用单个特异引物扩增桃ACC氧化酶3cDNA及其在大肠杆菌中的表达233122金勇丰张耀洲陈大明张上隆(1浙江农业大学生物化学研究所杭州310029)(2浙江农业大学园艺系杭州310029)摘要用单个特异引物和通用引物oligo(dT)15从桃受伤叶片cDNA中扩增出1.3kb左右大小的片段.将该扩增产物克隆并对重组克隆作酶切分析发现至少可分为3类.用桃ACC氧化酶基因组DNA为探针进行点杂交表明,4,7,9,10,1
2、1,12重组质粒能与之杂交,其中7,9,10,11,12号重组质粒酶切图谱与已报导的桃果实成熟相关的ACC氧化酶cDNA基因基本一致,而4号克隆则不同.DNA序列分析和PCR鉴定表明,插入片段均由5′端特异引物单个引物扩增出来,对7号重组克隆插入片段DNA全序列分析表明,7号重组克隆插入片段全长1146bp,包含了除启始密码子外的全部编码区和192bp的3′端非编码区.通过补上起始密码子ATG构建重组表达载3体,在大肠杆菌中表达出35×10的非融合蛋白.关键词桃(Prunuspersica);单个特异引物;ACC氧化酶基因;克隆;表
3、达中图法分类号Q784ØS662.1AMPLIFICATIONOFPEACHACCOXIDASEcDNABYSINGLESPECIFICPRIMERANDEXPRESSIONINE.COLI233122JINYongfeng,ZHANGYaozhou,CHENDaming&ZHANGShanglong(1InstituteofBiochemistry,ZhejiangAgriculturalUniversity,Hangzhou310029)(2DepartmentofHorticulture,ZhejiangAgricultura
4、lUniversity,Hangzhou310029)AbstractOnespecificprimerandoligo(dT)15wereusedtoamplifyabout1.3kbfragmentinsamplesofcD2NAtomRNAisolatedfromwoundedleaveofpeach(Prunuspersica).ThreedifferenttypesofPCRcloneswereisolated,oneofwhichwasidenticaltotherestrictionendonucleasepatter
5、nofACCoxidasecDNArecentlyisolat2edbyCallahanetal.DotblottingindicatedtwodifferenttypeofclonescouldhybridizewithACCoxidasegene.DNAsequencingandPCRindicatedalloffragmentswereamplifiedbysingle5′specificprimer.Fulllengthnu2cleicacidsequenceofrecombinantpGEM2AC27wasdetermin
6、edandwefoundrecombinantpGEM2AC27was1146bplong,inculdingallopenreadingframeexceptinitiationcodonATGand192bp3′2endnon2codingrea23gion.ExpressionvectorwasconstructedbyaddinginitiationcodonATGand35×10non2fusedproteinwasex2pressedinE.coli.KeywordsPrunuspersica;Singlespecifi
7、cprimer;ACCoxidasegene;Cloning,ExpressionACC氧化酶是乙烯生成的关键酶之一,它直接催化ACC氧化成乙烯.虽然加入ACC后很容易检测植物体内该酶的活性,但对该酶的提纯一直没有成功.直到发现由番茄ACC氧化酶基因pTOM13的核苷酸序列推导出氨基酸序列中具有黄烷酮232羟化酶的同源序列,才用提取该酶的类似方法首次从甜瓜中分离到有活性的收稿日期:1997205219修回日期:1998205225接受日期:19982062263国家和浙江省自然科学基金(No:39870502和396278)和农业部
8、“九五”重点课题(No:95农217201204203)资助项目33联系人(Correspondingauthor)56应用与环境生物学报5卷[1,2][3][4][5][6][7]ACC氧化酶.如今已相继从苹果、水稻、矮牵牛、康乃馨
