动物组织DNA提取方法

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1、对动物组织ＤＮＡ提取方法的改进摘要：以小型哺乳动物社鼠为例，通过调整酚与氯仿的比率、减少抽提次数及消化时间，对采用－７０℃超低温冰箱、－２０℃低温冰箱、７０％乙醇液浸泡、９５％乙醇液浸泡和含５０ｍｍｏｌ／Ｌ乙二胺四乙酸二钠的７０％乙醇液浸泡等不同方法保存的社鼠肌肉组织提取基因组ＤＮＡ，并对其进行微卫星指纹图谱分析，研究了改进方法对不同方法保存的社鼠肌肉组织提取ＤＮＡ的效果，并比较了不同保存方法对ＤＮＡ提取效果的影响．结果表明：改进方法可行，完全可以满足微卫星等分子标记技术的需要．关键词：社鼠；ＤＮＡ提取；聚合酶链反应；动物组织；样品保存中图分类号：Ｑ９５

2、-３文献标识码：ＡＤＮＡ（ＲＡＰＤ）、微卫星（ＳＳＲ）、扩增片段长度多态法（ＡＦＬＰ）等各种分子标记（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒ）技术如雨后春笋般地发展起来．这些分子标记技术在生态学、保护生物学以及遗传育种、基因图谱的构建、品种鉴定、生物遗传多样性等方面的研究中得到了广泛的应用［１-６］．以ＰＣＲ技术为核心的分子标记，无论采用哪种分子标记技术，都必须提取纯化结构完整的ＤＮＡ．就目前应用较为广泛的ＤＮＡ提取方法而言，高盐法提取ＤＮＡ虽然简便、快速，但所提取的ＤＮＡ纯度及稳定性较差，影响后期的聚合酶链反应；经典的酚-氯仿抽提法则由于消化时间长及抽提步骤繁

3、琐，影响实验的进程．因此，有必要在动物组织ＤＮＡ提取方法上进行改进．笔者以小型哺乳动物社鼠（Niviventerconfucianus）为例，参考文献［７］的方法，对经典的酚-氯仿抽提方法进行了改进，通过调整酚与氯仿的比率、减少抽提次数及消化时间，对采用－７０℃超低温冰箱、－２０℃低温冰箱、７０％乙醇液浸泡、９５％乙醇液浸泡和含５０ｍｍｏｌ／Ｌ乙二胺四乙酸二钠（ＥＤＴＡ）的７０％乙醇液浸泡等不同方法保存的社鼠肌肉组织提取基因组ＤＮＡ，将所提取的基因组ＤＮＡ进行微卫星指纹图谱分析，探讨了改进方法对不同方法保存的社鼠肌肉组织进行ＤＮＡ提取的效果及影响．１材料

4、和方法1．1动物标本及处理笼捕社鼠５只，带回实验室处死，迅速取腿部肌肉组织分成５份，２份装入样品袋，分别置于－２０℃和－７０℃冰箱中保存；３份分别置于盛有约１００ｍＬ９５％乙醇溶液、７０％乙醇溶液和含５０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ的７０％乙醇溶液的小口塑料瓶中固定．样品保存２个月，用于模版ＤＮＡ的提取．动物解剖在无菌操作台上进行，用于解剖不同个体的解剖器具严格分开和清洗，防止交叉污染．1．2试剂细胞裂解液（１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１００ｍｍｏｌ／ＬＮａ２ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０），５ｇ／Ｌ十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ）），核糖核酸酶Ａ（ＲＮａｓｅ

5、Ａ，６０Ｕ／ｍｇ），蛋白酶Ｋ溶液（２０ｍｇ／ｍＬ），Ｔｒｉｓ-饱和酚，氯仿-异戊醇（体积比２４∶１），ＴＥ（１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍｍｏｌ／ＬＮａ２ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））和灭菌双蒸水（ｄｄＨ２Ｏ）．1．3肌肉组织DNA提取取固定剂固定肌肉样品，用灭菌ｄｄＨ２Ｏ清洗样品表面３次，滤纸吸干表面水分．取肌肉组织１５０～２００ｍｇ，切碎，转移至１．５ｍＬ离心管中（每份样品取２份），然后加入８００μＬＤＮＡ提取液（提取液预热，以抑制脱氧核糖核酸酶（ＤＮａｓｅ）的_______活性，加速蛋白变性，促进ＤＮＡ溶解）和６．５μＬ蛋白酶Ｋ溶液

6、，置于旋涡振荡器上混匀后，５５℃水浴下消化约４ｈ，不时轻摇混匀，直至溶液透明，４℃６０００ｒ／ｍｉｎ离心８ｍｉｎ；取上清液８００μＬ置另一离心管中，加入１μＬＲＮａｓｅＡ溶液，混匀，３７℃水浴４０ｍｉｎ，冷却至室温，加入７００μＬＴｒｉｓ-饱和酚、１００μＬ氯仿-异戊醇（体积比２４∶１），混匀仪上混匀１５ｍｉｎ，４℃１０８００ｒ／ｍｉｎ离心１２ｍｉｎ；取上清液６５０μＬ置另一离心管中，加入６５０μＬ氯仿-异戊醇（体积比２４∶１），混匀仪上混匀１５ｍｉｎ，４℃１０８００ｒ／ｍｉｎ离心１２ｍｉｎ；转移上清液４５０μＬ至新离心管中，加入９００μＬ预冷的无水乙醇

7、，－２０℃沉淀ＤＮＡ１～２ｈ，４℃１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ；弃上清液，７０％乙醇溶液４００μＬ洗涤沉淀３次（倒掉液体后再短暂离心，将残液用移液器吸出），干燥ＤＮＡ，溶于１５０μＬＴＥ中．1．4DNA质量检测将样品稀释５０倍，以ＴＥ做空白对照，分别在２６０ｎｍ、２８０ｎｍ波长处用紫外可见分光光度计测定ＤＮＡ稀释液的吸光度值，计算ＤＮＡ的含量．通过１％琼脂糖凝胶电泳检测提取的总ＤＮＡ片断大小及ＤＮＡ的降解情况．对提取的总ＤＮＡ利用微卫星引物进行ＰＣＲ扩增，检测ＤＮＡ扩增情况．第３期鲍毅新，等：对动物组织ＤＮＡ提取方法的改进及ＰＣＲ检测３1．5PCR

8、扩增１．５．１微卫星位点的选择选取４对筛选自大、小鼠适用于社鼠的微卫星引物（待发