福尔马林固定动物组织的DNA提取方法的探讨【文献综述】

《福尔马林固定动物组织的DNA提取方法的探讨【文献综述】》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、毕业论文文献综述水产养殖福尔马林固定动物组织的DNA提取方法的探讨摘要：本文主要介绍福尔马林固定动物组织的DNA提取的方法的探讨。关键词：福尔马林固定；DNA提取　分子系统学的研究首先必须获取足够含有遗传信息的生物样品，既包含有核酸、蛋白质的样本。但在实际工作中有时要获得足够样品非常困难，如对于种群小、濒危、分布区窄的动物来说，采集标本的成功率较低。如何从馆藏标本中获取需要分析的遗传样品，成为了分子系统学研究探索的途径。首先，馆藏标本由于多年的积累，收藏标本齐全，花费较小的人力、物力就可获得分子系统学研究样品；其次，减少了对现有动物的干扰，对于珍稀动物这点尤为重要；第三，通

2、过馆藏标本的研究，排除了由于遗传物质转移、物种迁移等形成的系统分析的混乱。并且从标本的类型来说，模式标本、地模标本等在系统学研究中的作用有很大差别，前者更具有说服力。所以，如能从馆藏标本中直接获得实验样品，将极大的有利于动物系统学的研究。核酸的分离与纯化是分子生物学研究中重要的技术，现有的DNA提取与纯化方法一般只适用于新鲜材料，虽然对于一些较为特殊材料的DNA提取已提出一些专一方法，但是对于福尔马林长期保存生物标本基因组DNA的提取至今未能彻底解决。作为生物标本的保存液，福尔马林的优点在于渗透力强、防腐杀菌效果好、固定速度快,具有能快速杀死生物细胞以固定生物大分子的功能。

3、因此在过去的若干年中,世界各国生物学家采集了大量生物标本并保存于福尔马林中,这些标本在研究物种起源、系统进化、特定物种基因资源保护以及生物多样性等方面具有很高的学术研究价值。如不能正常提取基因组总DNA,就会给从分子水平上比较研究这类生物带来障碍。1.历史实验方法整理1.1方法一：1.1.1标本的预处理取浸泡于福尔马林中大仓鼠肝脏或日本鳗鲡肌肉适量，用PBS溶液冲洗，放在灭菌的吸水纸上将其揩干，于超净工作台内用无菌剪刀将材料剪成50mg的小块，放入PBS液浸泡12～24h后转入70%的乙醇中处理12～24h。依次换入下列梯度酒精中处理：80%乙醇，2h，重复一次；90%乙醇

4、，2h，重复一次；95%乙醇，2h，重复一次；100%乙醇，1h，重复一次。然后将材料放入1/2倍的PBS液中浸泡12h，其间更换一次溶液。1.1.2基因组DNA的提取与纯化提取方法参考Sambroock等人(1989)，部分步骤加以改进。加蛋白酶K的量按标准量(100μg/mL)，在50～56℃温度3～6h处理过程中，不断轻摇混匀，视消化效果可以重复加入标准量的1/2倍蛋白酶K进行消化，直至将材料完全消化为止；酚氯仿抽提最后一次的上清液移入透析袋中透析；沉淀DNA时，在-20℃下20min效果为宜[1]。1.2　方法二：1.2.1固定标本的处理(1)取约2.0g浸泡于福尔

5、马林溶液中的大仓鼠肝脏标本，置于广口称量瓶中，用70％乙醇冲洗2次。（2）使用灭菌牙签将组织分成0.3cm³左右的小块，分装于几只1．5ml灭菌离心管中。(3)接下来依以下程序进行处理：PBS(磷酸盐缓冲液)缓冲液处理24h→70％乙醇处理12h→无水乙醇处理12h→1/2PBS处理24h→灭菌水清洗1次→GTE(甘氨酸)缓冲液处理24h→1/2PBS处理24h→灭菌水清洗1次→最后用蒸馏水清洗至少3次，弃去处理液并用滤纸吸水备用。[2]1.2.2基因组DNA的提取(1)将已经预处理的标本组织分别置于1.5ml离心管中，在每只离心管中先加入600uLDNA抽提缓冲液，机械碎

6、裂组织块直至粉末状，颠倒混匀后放于37℃水浴锅里水浴1h。(2)取出离心管，每只各加15～20uL蛋白酶K(浓度为l0ug/uL)，然后55℃水浴，消化3h甚至过夜，其间应不时混匀。(3)加入等体积tris饱合酚，温和摇动10min；10000rpm，4℃离心10min，将上清液转移至另一只干净离心管中，加入等体积Tris饱合酚再抽提1-2次。(4)然后加入等体积酚：氯仿(1∶1)抽提和氯仿抽提各1次。(5)上清液用无水乙醇-20℃沉淀DNA约30min。(6)70％乙醇漂洗2次。无水乙醇沉淀5min，4℃稍离心。(7)室温干燥后用适量无菌水溶解DNA。1.3　方法三：1.

7、3.1DNA提取　用消毒的剪刀取福尔马林固定标本大腿肌肉，切成0.1cm³，用70%的酒精清洗48h，中间间隔2h左右换一次溶液。酒精清洗完毕后，用去离子水洗涤3次，在60℃温度的烘箱中彻底烘干。取已灭菌Eppendorf管加入600µL的消化液,消化液的配方为STE500μL；10%SDS60µL蛋白酶K(0.01g/mL)30μL；DTT(1mol/L)24μL。将上述烘干材料，放进坩埚加入一定的液氮磨碎成细粉，移入消化液，55℃消化30h。在消化的过程中每间隔3h将样品缓慢颠倒一次。消化结束后，4500r/m