毛囊组织dna提取方法的研究

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1、药物性耳聋线粒体12SrRNA基因1555G点突变基因检测的实验室技术体系人头发毛囊组织DNA提取方法的研究技术保障与研发部魏宏泉摘要本研究以人头发的毛囊组织为材料，在动物组织总DNA提取的经典技术方案基础上，兼顾效率、成本和产率等三方面因素，对毛囊组织DNA提取方法进行了优化，并设计了实用有效的取样方法。研究结果显示，可以以少至一根带毛囊的头发为材料，在40分钟时间内获得约0.5mg组织DNA，其产量和质量可以满足基因检测工作后续流程的需要。同时，一次提取过程所耗药品试剂的成本约为0.3元，大大低于以微量血为材料

2、的试剂盒提取法的成本。在以RFLP法对线粒体12srRNA基因1555位点进行基因检测的技术体系中，组织DNA提取是实验室工作的第一步，该工作的效率、质量、成本等因素对整体检测流程具有至关重要的影响。在此之前的研究工作中，我们确定了以微量血为材料提取组织DNA的技术方法，但为了使基因检测项目的实施具有更强的可操作性，设计多样化的组织样本采集形式则是必需的。为此，本研究以人头发毛囊组织为材料，旨在建立适用的取样方法和DNA提取方法的技术体系。1.材料与方法人头发毛囊组织取自健康成年人。取样方法：用镊子夹住头发根部的部

3、位，顺着毛发生长方向用力一拔即可，此时在毛发根部应明显可见白色或半透明的毛囊组织。然后用剪刀剪去大部分的毛干部分，将毛根带有毛囊组织的部分置于1.5mlEppendorf管内。试剂配制（1）ProteinaseKProteinaseK用去离子水溶解，浓度20mg/ml。（2）组织消化液10mMTris-HCl，pH7.510mMEDTA10mMNaCl0.5％SDS（3）LiCl溶液无水LiCl用去离子水溶解，浓度为7.5M。（4）TE溶液10mMTris-HCl，pH7.50.1mMEDTA，pH8.0参考操作程

4、序（1）加入60ml消化液，再加入1ml蛋白酶K溶液，用涡旋混合器震荡5秒钟。（2）于55℃水浴2小时。7药物性耳聋线粒体12SrRNA基因1555G点突变基因检测的实验室技术体系（1）加入60mlLiCl溶液，用涡旋混合器震荡5秒钟，冰浴10分钟。（2）13000rpm离心15分钟，将上清移入一个新的离心管中。（3）加入240ml无水乙醇，颠倒混匀后室温放置10分钟。（4）13000rpm离心10分钟，弃上清，用70％乙醇将沉淀洗一次。（5）13000rpm离心5分钟，弃上清，并将残留乙醇吸干净，室温干燥20分钟

5、。（6）加入20mlTE缓冲液溶解DNA。（7）用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。头发数量对DNA提取结果的影响将拔取的头发分为6组，分别为1、2、3、4、5、6根头发，按1.3中的参考操作程序进行操作，提取DNA并用电泳检测结果。蛋白酶K消化对DNA提取结果的影响（1）将拔取的头发分为4组，每组1根，在操作程序中加入蛋白酶K后，55℃水浴时间分别为15分钟、30分钟、45分钟、60分钟，其余步骤按参考操作程序进行。（2）将拔取的头发分为6组，每组2根，在操作程序中加入蛋白酶K后，55℃水浴时间分别为0分钟、10分钟、

6、20分钟、30分钟、60分钟，其余步骤按参考操作程序进行。（3）将拔取的头发分为6组，每组2根，其中5组在操作程序中加入的蛋白酶K浓度分别为20mg/ml、10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml，最后一组不加蛋白酶K，其余步骤按参考操作程序进行。（4）将拔取的头发分为5组，每组1根，在操作程序中不进行加入蛋白酶K及水浴步骤，其余步骤按参考操作程序进行。优化操作程序的多样本比较实验以五个人为对象，各拔取两根头发作为样本分为两组，每组一根头发，共计10组，以下列操作程序提取DNA：（1）加入

7、60ml消化液，再加入1ml蛋白酶K溶液，用涡旋混合器震荡5秒钟。（2）于55℃水浴10分钟。（3）加入60mlLiCl溶液，用涡旋混合器震荡5秒钟，冰浴10分钟。（4）13000rpm离心10分钟，将上清移入一个新的离心管中。（5）加入240ml无水乙醇，颠倒混匀后室温放置10分钟。（6）13000rpm离心10分钟，弃上清，用70％乙醇将沉淀洗一次。（7）13000rpm离心5分钟，弃上清，并将残留乙醇吸干净，室温干燥20分钟。（8）加入20mlTE缓冲液溶解DNA。（9）用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。（10）

8、各取2mlDNA溶液作为模板进行PCR，PCR反应体系及程序设置按照“药物性耳聋易感基因检测的RFLP标准操作程序”进行。2.结果与分析7药物性耳聋线粒体12SrRNA基因1555G点突变基因检测的实验室技术体系2.1头发数量对DNA提取结果的影响以1-6根头发为材料，每组都可以有效提取出基因组DNA，1-3根头发组的DNA产量有较为明显的随头发数增多而产量