试验四-人毛囊dna的快速提取及pcr检测性别m

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1、实验四人毛囊DNA的快速提取及PCR方法检测SRY基因判断性别实验目的掌握毛囊DNA的快速提取方法及其原理掌握DNA的电泳检测技术学习PCR扩增DNA的原理，掌握PCR操作步骤掌握利用PCR技术扩增SRY基因判断性别的原理试验内容一毛囊DNA的快速提取与检测二PCR扩增进行性别鉴定前期准备前期处理：挑出毛发10根，尽量剪短至只剩下毛囊，去除毛根，放入干净的EP管中。加入PH8.0的灭菌水清洗1-2次，离心后吸出水PCR扩增进行性别鉴定PCR试验原理聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)是当今现代分子生物学的三大主流技术之一。PC

2、R扩增产物检测用浓度为1-2%的琼脂糖凝胶对PCR产物（DNA）进行电泳分离。琼脂糖凝胶中有很多小孔隙，起一个分子筛的作用，DNA在电场的作用下由负极往正极移动穿过这些孔隙，DNA迁移速率与电场强度成正比，与DNA分子量大小成反比。从而将大小不同的DNA片段分离开来。SRYPCR产物大小：501bpGAPDHPCR产物大小：565bpPCR扩增体系10ul总体系：H2O7×10=70Buffer1.010Primer-F0.33Primer-R0.33dNTP0.33Taq0.11Template(毛囊DNA)1.0ulPCR扩增程序95℃,4min;94℃,3

3、0s;60℃,30s;72℃,30s;Goto230循环72℃,5min;4℃,5min.方法一酚仿抽提法试剂：10%SDS、蛋白酶K(20mg/ml)、苯酚、氯仿、异戊醇、乙醇TE10mmol/LTris-Hcl,PH=8.0;1mmol/LEDTA,PH=8.0步骤酚仿抽提法优缺点：该方法提取的DNA浓度不是很高，中间步骤过多会损失大量的DNA，所以如果是很细小的毛，并且量不多，不建议使用此方法。但是此方法提取的DNA质量较好，扩增效果好。酚仿抽提法图1.酚仿抽提法检测结果方法二、碱裂解法于装有毛囊的EP管中加入0.2mol/L的NaOH溶液50μL，煮沸1

4、5min后，瞬时离心，吸取上清液至另外一只干净的离心管中加入PH=6左右的Tris–HCl50μL，13000r离心2min将上清液转移到另外一只EP管中即可。方法二、碱裂解法优缺点：该方法提取步骤较简单，提取周期短，并且DNA损失量较少，提取效率高。但PH值不容易调节以至于会影响到后续PCR扩增。因此如果PCR扩增效率不高的引物，不建议用该方法提取。方法三、PCR扩增法试剂：10×PCR缓冲液、Mg2+、蛋白酶K(20mg/ml)实验步骤：按以下体系配制毛囊裂解液：10×PCR缓冲液100μLMg2+80μL蛋白酶K(20mg/ml)1μLddH2O819μL

5、方法三、PCR扩增法加入上述裂解液15μL于放有毛囊的EP管中在PCR仪上设置一个单循环程序:65℃30min,95℃15min,4℃10min。将上一步骤中的PCR试管放入预热好的PCR仪中,运行该程序；吸取上清液于干净的EP管中即可；方法三、PCR扩增法优缺点：该方法提取DNA的效率较高，可获得较多的DNA，并且需要的毛囊量较少。较细且少量的毛囊建议用此方法提取DNA。但是该方法抽提的DNA质量不是很好，扩增的时候需加大DNA加入量，并且扩增的结果中可能会有大量杂带。图2：PCR法抽提检测结果电泳检测制备1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测DNA具有结合EB分子的能

6、力，在紫外灯下产生荧光的信号二PCR扩增进行性别鉴定性别鉴定原理人类男性的性染色体组成是XY，女性的性染色体组成是XX，因而通过对一些在Y染色体上所特有的基因（如SRY基因）进行PCR扩增分析，即可对性别进行鉴定。本试验通过对毛囊DNA中的SRY基因进行PCR扩增分析进行性别鉴定，扩增呈阳性的为男性，扩增呈阴性的为女性。同时以常染色体上的GAPDH基因为阳性对照，男女皆能扩增出产物。人类SRY基因的序列用于性别鉴定扩增的引物序列扩增退火温度：60ºC