兔肌腱细胞与成纤维细胞生物学特性研究

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1、·46·ChineseJReparativeandReconstructiveSurg,1997,Vol11(1)·实验研究·△兔肌腱细胞与成纤维细胞生物学特性研究112张前法杨志明彭文珍摘要为了研究在体外培养条件下,肌腱细胞与成纤维细胞的生物特性,按Henderson方法作兔肌腱细胞与皮肤成纤维细胞体外培养,观察细胞形态、贴壁时间及延展时间。采用免疫组织化学的方法对细胞合成胶原的类型进行了测定。结果表明:两种细胞未贴壁前均呈圆形,贴壁后呈梭形或多角形。成纤维细胞的贴壁时间、延展时间较肌腱细胞快;贴壁后细胞群体的排列方向,肌腱细胞群体排列趋于一致、规则

2、,成纤维细胞排列呈不规则。肌腱细胞合成É型胶原,成纤维细胞合成É和Ë型胶原。根据细胞的贴壁时间、延展时间、排列方向及合成胶原类型,可以区分肌腱细胞及成纤维细胞。关键词肌腱细胞成纤维细胞胶原体外培养3有关肌腱愈合机制的研究已有很多报道。由于腱段剪成1～2mm碎块,再用上述浓度的胰蛋白酶在体内的研究受很多因素影响,因而已有不少的研及胶原酶消化1h,中止消化后过滤除去碎块,滤液究在体外进行。至今对肌腱细胞及成纤维细胞参与以1000römin离心10min,去上清液。下层液用培肌腱愈合的机制尚不完全清楚。自Dehm1971年体养基洗脱一次,加培养液,制成细胞悬

3、液。按细胞计5外培养鸡胚肌腱细胞成功以来,对肌腱细胞的研究数5×10个öml接种于培养瓶中培养。逐步深入,其生物学特性也逐步被认识。为了探索肌1.4成纤维细胞培养腱细胞与成纤维细胞在体外培养条件下的生物学特切取兔背部皮肤2cm×2cm,Hank’s液洗涤后3剪成1mm碎块,用0.25%胰蛋白酶及0.1%胶原性,设计了本实验研究。酶消化1h,中止消化后滤除组织碎块,滤液以1000römin离心10min,于沉淀液中加入培养液,制1材料与方法5成细胞悬液,按细胞计数5×10个öml接种于培养1.1组织来源瓶中培养。切取新西兰白兔后肢屈趾肌腱与背部皮肤。培养

4、液由F212培养基加20%新生小牛血清,青1.2F212培养基霉素100Uöml,链霉素100Lgöml。系Sigma公司产品,新生小牛血清系华西医科在原代培养的肌腱细胞、成纤维细胞融合成单大学分子生物研究室产品,均经过滤除菌及去支原层细胞后,适时进行传代培养。体处理。1.5免疫组化法测定胶原类型1.3肌腱细胞培养选用第2代冻存的肌腱细胞、成纤维细胞复苏。按Henderson分步酶消化法分离、培养兔肌腱在培养瓶中置入2cm×2cm大小的载玻片,肌腱细细胞。首先在放大镜下去除肌腱外膜组织,Hank’s胞继续培养7d,成纤维细胞培养5d,在载玻片上细液洗涤

5、3次,用0.25%胰蛋白酶及0.1%胶原酶将胞贴壁生长以后,用胶原É、Ë染色观察。整段肌腱在37℃水浴箱中消化20min后,用新生小牛血清中止消化,再次用Hank’s液洗涤3次,将肌2结果2.1细胞的形态特征△国家自然科学基金资助项目刚游离出的肌腱细胞、成纤维细胞均呈圆形,有美国中华医学基金会(CMB),四川省卫生厅基金部分强烈的折光性。贴壁后的肌腱细胞与成纤维细胞均资助1华西医科大学附属第一医院(四川成都,610041)呈梭形或多角形,两端有突起(图1)。分别观察原代、2华西医科大学基础医学院分子生物研究室传代肌腱细胞与成纤维细胞各3瓶,成纤维细胞群

6、中国修复重建外科杂志1997年第11卷第1期·47·体排列不规则,而肌腱细胞群体排列趋于规则或呈胞生长的载玻片上胶原É和胶原Ë染色均为阳性平行排列。(图4,5)。2.2细胞贴壁及延展时间对刚分离的原代及传代细胞在倒置显微镜下观察,当摇动培养瓶,细胞不再随培养液移动时为贴壁,所需的时间为贴壁时间。观察到细胞从圆形伸出伪足延展为梭形细胞的时间为细胞延展时间。原代成纤维细胞平均贴壁时间为26h,延展为36h。传代的成纤维细胞贴壁时间为4h,延展时间为8h,5d左右形成单层细胞。原代肌腱细胞贴壁时间为48h,延展时间为60h;传代的肌腱细胞贴壁时间为8h,延展

7、时间为18h。2.3细胞胶原染色将有肌腱细胞和成纤维细胞生长的载玻片,分别用胶原É、Ë染色,呈棕黄色者为阳性染色。在有肌腱细胞生长的载玻片上。胶原É染色呈阳性反应图1原代肌腱细胞贴壁后,延长为梭形(HE×250)(图2),胶原Ë染色呈阴性反应(图3)。有成纤维细图2肌腱细胞培养7d后,胶原É染色呈阳性(×300)图3肌腱细胞培养7d后,胶原Ë染色呈阴性(×300)图4成纤维细胞培养5d后,胶原É染色呈阳性(×300)图5成纤维细胞培养5d后,胶原Ë染色亦呈阳性(×150)Gary研究了体外培养的鸡胚角膜、心肌及皮肤3讨论来源成纤维细胞的区别时发现,在单

8、个细胞形态、细Greenlee[1]用电镜观察肌腱发育过程中各种成胞传代能力方面存在一定差异。