梅山猪耳成纤维细胞系生物学特性分析

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1、学校代码：10264研究生学号：M150104113上海海洋大学硕士学位论文题目：梅山猪耳成纤维细胞系生物学特性分析BiologicalCharacteristicAnalysisofEar英文题目：FibroblastCellLinesofMeishanPig专业：临床兽医学研究方向：动物胚胎工程姓名：张宏丽指导教师：张德福研究员二O一八年四月十二日上海海洋大学硕士学位论文上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注李家乐上海海洋大学教授主席刘惠莉上海市农业科学院研究员委员李震上

2、海市农业科学院研究员委员蒋杰贤上海市农业科学院研究员委员郑洪建上海市农业科学院研究员委员范晓芬上海市农业科学院助理研究员秘书农科院华漕院区机答辩地点答辩日期2018.05.25关楼二楼会议室上海海洋大学硕士学位论文本研究由国家自然科学基金（31372315）；嘉定区农业和社会事业项目（2016004）；上海市农业科学院攀高计划（PG171）提供资助梅山猪耳成纤维细胞系生物学特性分析摘要我国地方猪种资源十分丰富，拥有很多独特的遗传特性，受到国内外育种者的高度重视。然而由于各种原因，有些地方猪种数量急剧

3、下降，甚至绝种，因此需要应用生物技术来保存地方猪种种质资源。体细胞冷冻因简单、有效和更具可操作性，且采集时不影响动物健康，越来越受到重视，在优良种畜资源、濒危物种保种中具有广泛的应用前景。梅山猪是我国一个优良的地方品种，以其繁殖力高、肉质鲜美而著称。为保存梅山猪种质资源，本研究采用组织块培养法建立了梅山猪耳成纤维细胞系，并对所建细胞系进行生物学特性研究，以期使这一优良资源得到妥善保护，也为其他动物保种提供借鉴。以梅山猪耳缘组织为研究材料，采用组织块培养法建立了梅山猪耳成纤维细胞系，并对所建细胞系进行

4、生物学特性研究。结果表明：所建立的梅山猪耳成纤维细胞系生长态势良好，冷冻前后的平均细胞存活率分别为95.21%、90.08%，解冻后细胞的生长曲线呈“S”型；细菌、真菌和支原体3类微生物检测结果均为阴性，细胞没有受到微生物的污染；细胞中期染色体二倍体(2n=38)占主体约为92.31%，达到了建立成纤维细胞系的要求；苹果酸脱氢同工酶和乳酸脱氢同工酶电泳结果表明，该细胞系没有被其他细胞污染，细胞纯度较高；绿色I上海海洋大学硕士学位论文荧光蛋白（EGFP）基因转染耳成纤维细胞，5个细胞系的阳性率为45.

5、23%~67.32%。经G418筛选后，各个细胞系均能有效形成单克隆集落。本试验中梅山猪成纤维细胞系的建立使梅山猪种质资源在细胞水平得到有效保存，并可为其他动物成纤维细胞系的建立以及种质资源保存提供参考。探究不同浓度的抗氧化剂维生素E（VE）对梅山猪耳成纤维细胞传代过程中抗凋亡能力的影响。采用MTT法检测细胞增殖，JC-1检测线粒体膜电位，AnnexinV-EGFP/PI检测细胞凋亡率，以及RT-PCR检测BAX、Caspase-3、BCL-2、SOD-1基因mRNA表达水平的变化。结果表明，加入维

6、生素E培养细胞，细胞相对增值率和线粒体膜电位比对照组明显升高，细胞凋亡率明显降低，BAX、Caspase-3基因表达量和对照组（0µmol/LVE）没有明显差异（P<0.05），而BCL-2、SOD-1基因表达量比对照组明显升高，其中100µmol/LVE处理组的BCL-2基因表达量极显著高于对照组和50µmol/L处理组（P<0.01），并与150µmol/LVE处理组无显著差异（P>0.05）；100µmol/LVE处理组的SOD-1基因表达量极显著高于其他三组（P<0.01）。本试验表明，细胞

7、培养过程中添加100µmol/L的维生素E能够提高线粒体功能、抑制细胞凋亡和促进细胞增殖。探索冷冻保存对猪梅山猪耳成纤维细胞H19和IGF2R基因DNA甲基化的影响。采用亚硫酸氢盐测序和RT-PCR技术，检测了新鲜和冷冻保存细胞中H19和IGF2R基因的DNA甲基化状态和表达量，并对II上海海洋大学硕士学位论文甲基化相关基因的表达水平进行分析。结果显示，冷冻组中H19基因DMR1和DMR3的甲基化率（84.48%，69.17%）极显著高于新鲜组的甲基化率（58.28%，48.33%，P<0.01），

8、H19基因DMR2表现为去甲基化，极显著低于新鲜组中的甲基化率（26.40%vs48.00%，P<0.01），且该基因表达量极显著高于新鲜组（P<0.01）；IGF2R基因DMR2表现为超甲基化，极显著高于新鲜组中的甲基化率（75.88%vs42.94%，P<0.01），但IGF2R基因表达量并没有显著差异（P>0.05）。冷冻组中DNMT3A和DNMT1的基因表达量极显著高于新鲜组（P<0.01），DNMT3B基因表达量则没有显著差异（P>0.05）。本试验结果提示