LDS_聚丙烯酰胺凝胶电泳分析植物过氧化物酶同工酶

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1、植物生理学通讯第42卷第4期，2006年8月713LDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析植物过氧化物酶同工酶*王爽陈卫良浙江大学生物技术研究所，杭州310029AnalysisofPlantPeroxidaseIsoenzymesbyLDS-polyacrylamideGelElectro-phoresis(LDS-PAGE)*WANGShuang,CHENWei-LiangInstituteofBiotechnology,ZhejiangUniversity,Hangzhou310029,China提要以高粱和甘蓝型油

2、菜叶片为材料，用十二烷基磺酸锂不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳(LDS-PAGE)检测过氧化物酶同工酶的结果表明，LDS-PAGE的酶带条数比非变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳(nativePAGE)明显增加，分辨率大大提高，上样量少，胶片易保存；比复性电泳(G-PAGE)的步骤简单，电泳后无需除去LDS即可直接按常规活性染色方法染色。关键词LDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(LDS-PAGE)；过氧化物酶(POD)；同工酶过氧化物酶(peroxidase,POD)是一族能利用材料与方法H2O2氧化供氢体的酶，由1个糖蛋白和1个氯正

3、1实验材料铁血红素IX的铁卟啉辅基缀合而成(胡能书和万贤苗高3~5cm的高粱(SorghumbicolorL.)品种国1985)。它在高等植物中广泛而大量存在，是‘辽杂10号’叶片和甘蓝型油菜(Brassicanapus植物中最重要的氧化还原酶类之一。它具有多种L.)品种‘浙双758’的叶片。同工酶，在植物不同的生长发育时期和不同的组2试验方法织器官中，POD同工酶的数目和活性都有很大变2.1样品的制备称取高粱和油菜叶片各1.0g，洗化，因此，研究POD同工酶可以更好地用以了净，用纱布吸干后，放入液氮中，在预冷的

4、研解和调控植物生长发育过程。钵中加1mL提取缓冲液(0.1mol·L-1Tris-HCl,pH目前，研究POD同工酶通常用非变性不连续8.5)和0.1g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)研磨，匀浆以聚丙烯酰胺凝胶电泳(nativePAGE)(宋晓轩等4000×g离心10min，取上清液为粗酶液，分装1995)，其特点是在电泳过程中可以保持酶的活后贮存于-70℃冰箱中备用。以上操作均在0~4℃性，但这种电泳方法分辨率低，条带分离较模条件下进行。糊。姬生栋等(2000)用Neuhaus-Steinmetz等(1994)2.2蛋

5、白质测定参照Bradford(1976)检测法。的复性电泳技术(sodiumdodecylsulfate-gelatin-poly-2.3电泳acrylamidegelelectrophoresis,G-PAGE)研究小麦2.3.1nativePAGE参照Bollag和Edelstein(1992)POD同工酶，此法在染色前需要复性即除去的方法，用非变性不连续聚丙烯酰胺垂直平板电SDS，染色较繁琐，实验操作技术要求也较高。泳，浓缩胶为5%,分离胶为7.5%。样品蛋白在-1本文以高粱(SorghumbicolorL

6、.)和甘蓝型油菜上样缓冲液中的终浓度为1mg·mL，每孔上样量分别为5、10和20mL，在稳压55V、4℃条件(BrassicanapusL.)叶片为材料，采用变性作用比下电泳6~7h。SDS低的十二烷基磺酸锂(LDS)进行不连续聚丙烯2.3.2G-PAGE参照Bollag和Edelstein(1992)的方酰胺凝胶电泳(LDS-PAGE)分析POD同工酶并与nativePAGE进行比较，以期能找到一种更好、更收稿2006-02-15修定2006-06-02简便的检测植物POD同工酶的方法。*通讯作者(E-mai

7、l:chenwl@zju.edu.cn,Tel:0571-86971184)。714植物生理学通讯第42卷第4期，2006年8月法，略作改动：浓缩胶为5%，分离胶为9.5%，样品缓冲液中不加巯基乙醇，不加热，12000×g离心5min后，直接上样，每孔上样量5mL。电泳完毕后，参照姬生栋等(2000)的方法进行复性，即胶片用洗涤液(TritonX-1002.4mL、Tris-base0.6g、双重蒸水100mL,pH7.0)洗涤30min，再用双重蒸水洗涤2~3次，每次10min，以除去SDS。2.3.3LDS-

8、PAGE将G-PAGE中的SDS替换为LDS，每孔上样量3mL。除无需复性步骤外其余同2.3.2小节。2.4考马斯亮兰染色参照Bollag和Edelstein(1992)的方法。2.5同工酶染色参照胡能书和万贤国(1985)的方图1高粱叶片POD同工酶nativePAGE电泳图a:醋酸联苯胺染色;b:考马斯亮蓝染色。1、2、3上样量法，用醋酸联苯胺染色。分别为5、10、2