实验910植物过氧化物酶同工酶的测定凝胶圆盘电泳

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1、实验九--十植物过氧化物酶同工酶的测定（凝胶圆盘电泳法）生物化学实验之－－山东师范大学生命科学学院【实验目的】1.学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理；2.掌握聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳的操作技术；3.学习过氧化物酶同工酶的检测方法。【实验原理】以聚丙烯酰胺为支持介质的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺（Acr）单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成，具有三维网状结构，其网孔大小可由凝胶浓度和交联度加以调节。聚丙烯酰胺凝胶结构PAGE电泳兼有电荷效应和分子筛效应。由于被分离物质所载电荷数量、分子大小和形状的差异，因此在电泳

2、时产生不同的永动速率而相互分离。利用特异性的颜色反应使待测酶着色，这样就可以在凝胶中展现出酶谱。为了提高聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率,通常采用不连续聚丙烯酰胺凝胶系统，即在分离胶上面加一层浓缩胶，因浓缩胶和分离胶中的离子成分、pH、凝胶浓度不同，电泳开始后，由于浓缩效应,较厚的样品层可以被浓缩的很薄，使电泳具有良好的分辨率。过氧化物酶是植物体内常见的氧化酶。它能催化H2O2将联苯氨氧化成蓝色或棕褐色产物。因此，将经过电泳后的凝胶置于H2O2-联苯胺溶液中染色，出现蓝色或褐色的部位即为过氧化物酶同工酶在凝胶中存在的位置，多条有色带即构成过氧化物酶同工酶的酶谱。【器

3、材与试剂】（一）材料小麦芽（二）仪器设备稳流稳压电泳仪、冷冻离心机及离心管、成套电泳槽（圆盘型），pH试纸，其他常规用具（三）试剂1、分离胶缓冲液（pH8.9）2、分离胶贮液3、过硫酸铵溶液4、浓缩胶缓冲液5、浓缩胶贮备液6、电极缓冲液7、四甲基乙二胺（TEMED）8、0.1%溴酚蓝溶液9、联苯胺染色母液【实验步骤】（一）过氧化物酶的提取：取8~12粒发芽的麦粒，加入1mlH2O或0.5mol/LTris-HCl缓冲液（pH6.8），冰浴上研成匀浆。转入离心管，再用2ml上述溶液冲洗研钵壁并全部转入离心管，4000r/min离心10min，上清液供电泳分析用。

4、（二）凝胶的制备1.准备工作：（1）将一空心橡皮塞套在距玻璃管上端2cm处。（2）用封口膜封住玻璃管下端至不漏液体。3.制备小孔胶（分离胶）取2个小烧杯，按A:C:水:F等于1:2:1:3的比例，分别取A液、C液和水置于一小烧杯中，混匀；F液置另一小烧杯中。将两个小烧杯同时放在真空干燥器中同时抽气5～10min，可见有气泡冒出。将2个小烧杯内的液体倒在一起轻轻混匀（勿重新带入空气），用滴管先取少量凝胶液加至玻璃管内并甩几下，使液体置于底部，同时注意观察是否漏胶。然后尽快将其它凝胶液装入至达高度距上端口1cm为止。仔细地向表面加一层水以隔绝空气。此时可见水与胶之

5、间有一界线，但很快消失。将玻璃管垂直固定在一试管中，置25～35℃温箱聚合30～60min，当再次看到水与凝胶之间的界线时，表示聚合完成。吸去表面的水。4.制备大孔胶（浓缩胶）取2个小烧杯，按照B:D:E:F等于1:1.5:1:4的比例，分别取B液、D液和E液置于一小烧杯中，混匀；F液置另一小烧杯中，抽气。将2个小烧杯内的液体轻轻混匀加至小孔胶上面1cm高度，仔细地向表面加一层水。25～35℃聚合20～30min，聚合后的大孔胶呈乳白色。仔细吸去表面的水。（三）电泳1.安装电泳槽：向电泳槽下槽加入适量甘氨酸－Tris电泳缓冲液。去掉玻璃管下端的封口膜，将玻璃

6、管固定在电泳槽上，阴极在上，阳极在下。2.点样：取样品50μL，蔗糖－溴酚篮50μL,混匀，加入玻璃管中。加缓冲液至浸没过玻璃管上端口及电泳槽上盖的电极。排除玻璃管下端口的气泡，连接好电泳仪。3.电泳：开始电流为2~3mA/管，当样品至分离胶时，电流加大到4~5mA/管。当溴酚蓝指示剂接近管底时切断电源，终止电泳。4.剥胶：取下玻璃管，用装有长针头的注射器沿玻璃管内壁慢慢地边注水边进入，并试着沿玻璃管内壁轻轻转动针头。当胶条松动时，用洗耳球小心地将胶条压出，装于试管中。（四）染色：临用时配制染色液：（10ml）联苯胺母液0.5mlH2O9.3ml3%H2O2

7、0.2ml将染液倒入盛有凝胶条的试管中（没过胶条）。约10min后用自来水冲洗。（五）记录并计算：观察、记录酶谱，并计算各同工酶的相对迁移率。【要点提示】1.分离胶聚合时间应控制在30～60min，聚合过快使凝胶太脆易断裂，主要是AP或TEMED过量引起；聚合过慢甚至不聚合，可能是AP或TEMED用量不足或已失效。2.电泳时如果电泳槽盖上有冷凝水，则表示电压或电流过大，体系发热，可引起蛋白质变性、凝胶底部断裂等，应注意调整。特别是进入分离胶后应通过控制电压，调节电流不超过5mA/管。【思考题】1．说明不连续电泳中的浓缩效应主要是怎样引起的？2.为什么要在样品中

8、加入少许溴酚蓝和一定浓度的蔗糖溶液？3