植物同工酶凝胶电泳实验

《植物同工酶凝胶电泳实验》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、高级植物生理实验报告2014年12月28日植物同工酶凝胶电泳实验 一、实验目的和意义同功酶专指受遗传体系决定的酶的不同分子形式。从作用上看，分子形式不同的酶能做一样的工作，即催化同样的生化反应，所以把同功酶改称为同工酶。由于蛋白质分子的结构归根结底是由基因的DNA分子结构决定的，因此，同工酶就成为鉴定生物基因型是否有差别的可靠指标，在遗传育种，生长发育，物种起源，生理卫生等领域的研究中成为一种重要的工具；此外，同工酶还与植物抗性有一定联系，可用来鉴定抗性的强弱。本实验的实验目的主要是让学生掌握聚丙

2、烯酰胺凝胶电泳分析植物同工酶的原理及方法、步骤。提高学生的实际操作及动手能力。培养学生对实验结果的分析能力。二、实验原理带电粒子在电场中向带有相反电荷的电极移动，叫做电泳。在一定的pH条件下，每一种分子都具有一定的电荷、大小与形状，在相同的电场经一定时间的电泳，便会集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。不同组分的蛋白质（包括同工酶）分子组成、结构、大小、形状均有所不同，在溶液中所带的电荷多寡不同，在电场中的运动速度也不同。因此经过电泳便会分成不同的区带。然后用适当的染料着色，这样就可以在凝胶上展现

3、出蛋白质或同工酶的谱带。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作支持介质的一种电泳方法。它是由丙烯酰胺单体（Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下，聚合交联而成的三维网状结构凝胶。当Acr和Bis遇到自由基时，便能聚合。Acr和Bis的浓度、交联度可以决定凝胶的密度、粘度、弹性、机械强度以及孔径大小。三、材料不同品种的燕麦四、实验器材与试剂1.器材：电泳仪一套（稳压电源，垂直电泳槽和凹槽玻璃）；台式高速离心机；烧杯；微量进样器；注射器；皮头滴管；刻度吸；培养皿（染色用）

4、。2.试剂：丙烯酰胺（Arc）；甲叉丙烯酰胺（Bis）；四甲基乙二胺（TEMED）；过硫酸铵（AP）；三羟甲基氨基甲烷（Tris）；甘氨酸（Gly）；琼脂粉；溴酚蓝；甘油；联苯胺；醋酸；α-醋酸萘酯；β-醋酸萘酯；牢蓝RR盐；冰醋酸。3.试剂的配制：见表1五、实验步骤1．样品的提取称取1g不同处理的材料，加入少量提样缓冲液，置冰浴研磨成匀浆后定容至5ml，8000rpm离心6min，取上清液贮于冰箱备用。2．凝胶制备：（1）取电泳玻板，用去污剂洗净，蒸馏水冲洗，直立干燥。洗净的玻板内面要避免手指触

5、摸以防沾污。将玻板安装到电泳槽上。用电极缓冲液配制1.5%琼脂胶，沸水浴加热至琼脂完全溶化后，用皮头滴管沿板上部灌入两侧的封胶空隙，注意不要产生气泡。20分钟后凝固。（2）按照表1中的A液：B液：水：C液=1：2：1：4的比例配置凝胶，混匀后用一细玻棒引流，缓缓注入胶室中，注胶过程防止气泡产生。胶液加到与凹槽相平时停止，插入预先选择好的样品梳，注意不要带入气泡。（本实验为A液：B液：水：C液=2.5：5：2.5：10）3.点样及电泳：（1）向上下槽注入电极缓冲液，取下样品梳（不要拉断样槽隔墙）。将

6、少许提取液与溴酚蓝指示剂混合。用微量进样器针头插入样槽下部慢慢进样。每槽点样30μl。（2）上槽接负极，下槽接正级，接通电源，电流调至15~20mA，电压为200V，电泳至溴酚蓝标志到达凝胶前沿1cm处，将电流、电压调至零后断电。（3）电泳结束后，取下玻板，将两块玻板置自来水龙头下，借助水流，用解剖刀柄轻轻从板侧缝间撬开玻板（注意切忌从凹槽处撬），将胶放入染色液中。4.染色：（1）过氧化物酶染色联苯胺贮存液16ml（2g联苯胺溶于18ml文火加热的冰醋酸中，再加水72ml），0.6%过氧化氢16m

7、l，水48ml。将胶板浸入此液中，待出现兰色条带后，弃去染色液用水洗涤保存。（2）酯酶同工酶显色称取30mgα-醋酸萘酯，30mgβ-醋酸萘酯，50mg坚牢蓝RR（或坚牢蓝B），先用约4ml丙酮溶解，再用0.1mol/LpH6.5的磷酸缓冲液稀释到60ml，将胶板浸入此液中，室温下显色约20min，可看到桃红色的磷酸酯酶同工酶区带。弃去染色液，用蒸馏水漂洗，再用7%HAC固定。5.结果保存：将脱过色的凝胶按照颜色深浅绘成的谱带图作为实验报告的凭证。表1试剂配方溶液配方pH浓度A液1N盐酸48ml(

8、浓盐酸稀释到12倍)Tris36g蒸馏水定容至100ml四甲基乙二胺（TEMED）0.24ml8.97.5%B液丙烯酰胺（Arc）30g甲叉丙烯酰胺（Bis）0.8g蒸馏水定容至100mlC液过硫酸铵（AP）2g蒸馏水定容至100ml电极缓冲母液Tris6g甘氨酸（Gly）28.8g蒸馏水定容至1000ml（使用时稀释10倍）8.3提样缓冲液：电极缓冲液样品处理液：溴酚蓝0.2g溶于100ml蒸馏水中２染色液的配制A液：称取0.4g联苯胺，加入３ml冰醋酸，溶解后加入１７ml蒸馏水