实验四 同工酶分析

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1、实验四过氧化物同工酶分析掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）技术的原理和操作方法。掌握PAGE法分离过氧化物同工酶的原理和方法。【实验目的】1【实验原理】—聚丙烯酰胺凝胶电泳1.电泳概念带电粒子在电场中向与其电性相反的电极移动的现象。如：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳等。○○○○—++-+-2【实验原理】—聚丙烯酰胺凝胶电泳2.聚丙烯酰胺凝胶电泳由单体丙烯酰胺（Acr）和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在加速剂N,N,N,N-四甲基乙二胺（TEMED）和催化剂过硫酸铵（AP）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚

2、丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，简称PAGE)3【实验原理】—聚丙烯酰胺凝胶电泳4【实验原理】—聚丙烯酰胺凝胶电泳3.凝胶性能与总浓度及交联度的有关系T%（ACR和BIS的浓度）=（a+b）/m×100C%（交联剂百分比）=b/（a+b）×100其中：a为ACR克数，b为BIS克数，M为缓冲液体积4.凝胶浓度与孔径的关系T值浓度大，孔径小，移动颗粒穿过网孔阻力大。5【实验原理】—聚丙烯酰胺凝胶电泳6【实验原理】—过氧化物同工酶分析1.同工酶凡能催化同一种化学反应，但其分子结构和带电性质不同的一组酶称同工酶。植

3、物组织中的同工酶是基因表达的产物。在研究植物基因调控与生长发育、与环境条件的关系，以及许多生理生化和遗传问题时，常常需要分析同工酶谱的差异。7【实验原理】—过氧化物同工酶分析2.过氧化物同工酶植物体内常见的氧化酶。植物体内许多生理代谢过程常与它的活性及其同工酶的种类有关。利用过氧化物酶能催化双氧水把联苯胺氧化成蓝色或棕褐色产物的原理，将经过电泳后的凝胶置于有双氧水及联苯胺的溶液染色，出现蓝色或棕褐色产物的部位即为过氧化物同工酶在凝胶中存在的位置。8【仪器和试剂】实验仪器1.电子天平、垂直电泳槽、电泳仪等。实验材料和试剂A液：30%Acr-0.8%BisB液：T

4、ris+EDTAC液：TEMEDD液：10%AP9【实验方法与步骤】1.聚丙烯酰胺凝胶配方成分含量作用A液（30%Acr-0.8%Bis）4mL交联剂B液（Tris+EDTA）7mL缓冲液C液（TEMED）30μL加速剂D液（10%AP）50μL催化剂10【实验方法与步骤】2.样品制备称取小麦幼苗叶片0.5克，放入研钵内，加pH8.0样品提取液1mL，于冰浴中研成匀浆，转入离心管，在高速离心机上以8000rpm离心10分钟，取上清液，加入等量的上样缓冲液，混匀，即为样品液。11【实验方法与步骤】3.上样30-50μL12【实验方法与步骤】4.电泳接好电源线(上

5、槽接负极，下槽接正极)。打开电源开关，调节电压，以10V/cm稳定电压电泳，待前沿指示染料溴酚蓝下行至距胶板末端1-2厘米处，即可停止电泳。13【实验方法与步骤】5.剥胶、染色电泳结束之后，将垂直板从电泳槽上取下，小心地将两块玻璃板分开，并小心地将凝胶置于染色盒中，进行染色反应，染色10min，用蒸馏水漂洗1-2次。14【实验结果与分析】【讨论与心得】15