[精品]同工酶分析

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1、同工酶分析卖验组：周叨上午5组小组成员：張福超、热孜往古力、黄珍稀、叶金杰卖验时间：2011年11月一、实验目的1.掌握同工酶分析的方法技术。2.理解同工酶分析的遗传学意义。二、实验原理同工酶(isozymes)是指催化反应相同，但结构和理化性质不同的一族酶。是受遗传体系决定的酶的不同分子形式。结合利用电泳技术(根据分子量、电荷)，将不同的蛋口质区分开来，利用专一底物和特殊染料染色进行分析即可检验某一反应同工酶的种类、大小、含量及活性等。木实验屮共涉及酯酶(Est)和乳酸脱氢酶(LDH)两种体系同工酶，其屮Est是催化酯类化合物水解的

2、酶系是；LDH是催化乳酸脱氢反应的酶。两种同工酶产物的染色原理如下:1.Est：酯的水解产物■偶氮化合物(如坚牢蓝RR盐)结合产生红褐色物质。2.LDH：乳酸LDH内酮酸NADHNAD+三、实验材料黒腹果蝇(亲本、子代)、大果蝇、金鱼、小鼠实验内容1•凝胶制备2.提取酶液3.活性电泳4.染色分析五、实验方法和步骤1.配制分离胶(7.5%)：双蒸水/niL4.5mL1.5mol/LTris・IIC1(pH8.8)/mb2.5mLAcr/Bis(30%)/mb(有毒！)2.5mLTEMED/pL10PL10%Aps/uL50PL总体积/n

3、iL10mL注入两玻璃夹缝中（加到离短玻璃上缘2cm）,胶面上加1cm蒸谓水（自然凝胶后倾出、除干净）。2.提取晦液每份材料加入200ul匀浆缓冲液匀浆，匀好后倒入2nd离心管中，4°C,lOOOOtpm,10分钟，上清移入另一离心管中保存。3.4%浓缩胶的配制：双蒸水/mL3.1mL0.5mol/LTris・HC1(pH6.8)/mL1.25mLAcr/Bis(30%)/mL1.5mLTEMED/uL10uL10%Aps/uL25nL总体积/mL5mL加入两玻璃夹缝小，并在两玻璃板夹缝小水平插入梳子，待凝胶后小心拔出梳子（在缓冲液中

4、拔梳子）。4.样品制备：酶液10uL与上样缓冲液1011L（1:1）在PE手套上混匀5.加样：小心地向每个上样孔加入201JL的样品。电泳：4°C冰箱中，170v。6.停止电泳：指示剂澳酚兰移至底部约0.5cm时，切断电源。7.染色：小心从玻璃板中取下胶。去掉浓缩胶，将分离胶进行染色至酶带显色。8.脱色、固定、保存：染色后的胶蒸镭水清洗，并简单保存于蒸镭水中。4.照相六、实验结果照相结果如图所示：Est染色LDH染色分析得如下表格:样品带数图谱（由近及远）表示出宽窄、染色深浅颜色1.小鼠1234红褐红褐2.金鱼3.大果蝇4.黒腹果蝇米

5、本5.黒腹果蝇F16.小鼠7.金血&大果蝇9.黒腹果蝇亲本10.黒腹果蝇F112121212341111七、结果分析红褐亟红褐红褐红褐红褐迁移距离/厘米0.92.45迁移率3.984.582.403.552.403.552.403.550.94.580.8蓝紫1.9蓝紫1.9蓝紫1.9蓝紫0.60.180.490.7960.9160.480.710.480.710.480.710.180.60.80.9160.160.380.380.380.12由实验所得酶谱町以大致推断本实验所研究动物组织的脂酶与乳酸脱氢酶的多肽组成类型。条带的多少

6、体现了具冇不同多肽组成类型的酶的种类数，条带的宽度与染色深度体现了酶的含最与活性，条带的迁移率体现了没的分子最与带电最。八、参考资料1.现代遗传学原理，徐晋麟、徐沁、陈淳著，科学出版社20012.遗传学综合试验，李雅轩、赵听著，科学出版社2006