实验0X 果蝇变异的遗传标记实验——同工酶凝胶电泳.ppt

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1、实验0X果蝇变异的遗传标记实验——同工酶凝胶电泳（教材实验18，p85-89）一、实验目的：掌握同工酶分析的方法技术理解同工酶分析的遗传学意义二、主要实验内容：凝胶制备→提取酶液→活性电泳→染色分析助教：郑莹三、实验原理：同工酶（isozymes）是指催化反应相同，但结构和理化性质不同的一族酶。是受遗传体系决定的酶的不同分子形式。利用电泳分离（根据分子量、电荷）专一底物和特殊染料染色进行分析。配制分离胶（7.5%）（两组的量）：双蒸水/mL9mL1.5mol/LTris·HCl（pH8.8）/mL5mLAcr/Bis（30%）/mL

2、5mLTEMED/μL20μL10%Aps/μL100μL总体积/mL20mL同台两组共用一电泳槽。注入两玻璃夹缝中，胶面上加1cm蒸馏水（自然凝胶后倾出）。为节省时间，先做：架好胶板电泳原理介绍教师分头指导操作应用：遗传育种2）基因定位……酯酶（Est）:催化酯类化合物水解的酶系.乳酸脱氢酶(LDH):催化乳酸脱氢反应的酶.过氧化物酶（PO）：催化过氧化物水解本次实验涉及：LDH染色原理乳酸丙酮酸LDHNAD+NADHNBT(黄)NBTH(蓝紫)PMS（氢递体）Est染色原理酯的水解产物与偶氮化合物（如坚牢蓝RR盐）结合产生红褐色

3、物质．PO染色原理H2O2被PO水解，此过程中染料联苯胺显色（蓝褐色）．PO染色示意LDH4LDH3LDH5LDH1LDH2LDH电泳结果实例（1）D.Virilis------------10只（2）黑腹果蝇--P♀、P♂、F1♀、F1♂、F2♀、F2♂各40只（3）其他材料--0.2g四、实验材料：1份（7种果蝇样品+1种其他）/小组（1）、（2）的P、（3）由教师提供，（2）F1、F2用自己存的材料。已配制的各种试剂：1.组织匀浆液：100mmol/LNaCl-10mmol/LTris·HCl（pH8.0）-25mmol/LE

4、DTA（pH8.0）1).5mol/LNaCl2).0.5mol/LTris·HClpH8.03).0.5mol/LEDTApH8.02.1.5mol/LTris·HClpH8.8（4℃存放）3.0.5mol/LTris·HClpH6.8（4℃存放）4.30%Acr/Bis：29.2gAcr+0.8gBis→双蒸水定容至100mL→过滤→4℃存放5.上样缓冲液：0.25%溴酚蓝-40%（W/V）蔗糖水溶液6.电泳缓冲液（室温）：5×：Tris7.5g+Gly36g→双蒸水溶解定容至500mL。使用时稀释至1×——老师配好。要求自配[

5、都做Est。7种样品点完剩余的3孔点普通果蝇、大果蝇、其他，用于LDH（背讲台组）、PO（面讲台组）：醋酸а-萘酯240mg→溶于12mL丙酮中监牢蓝RR盐240mg→溶于12mL丙酮中→加216mLpH7.0磷酸缓冲液*两者完全溶解后把前者倒入后者中，迅速搅拌均匀，避光过滤。*pH7.0磷酸缓冲液（250mL）：10.9gNa2HPO4溶于152.5mL水中，3.0gNaH2PO4溶于97.5mL水中，二者混匀。Est染液（第一桌配，240mL，均分给各组(30mL×8)）7.染色液(电泳即将结束时配制完成)配制、染色要避光染色约

6、20分钟。LDH染液[第2桌配，60mL]:NAD+30.0mgNBT（氯化硝基四氮唑蓝）18.0mgPMS（吩嗪二甲酯硫酸盐）1.2mg乳酸钠0.7g0.5mol/LTris·Cl（pH7.1）4.4mL（老师提供）0.02gNaCl蒸馏水55.6mL染色约20分钟。PO染液[第3桌配，60mL]联苯胺1.0g冰乙酸9.0mL水36mLA液5.4mL30%H2O20.6mL水54mL溶，可研磨A液混合成为染色液染色5~10分钟，水洗停止反应。1.提取酶液五、方法步骤（合理分工、协调时间）每份材料（普通果蝇40只、大果蝇10只、或其

7、他材料0.2g）+400μL匀浆缓冲液匀浆匀浆液200μL匀浆液200μL用于RAPD实验提取DNA（冰浴操作）4℃，10000rpm，10分钟液体倒入1.5ml离心管液体倒入1.5ml离心管移上清于另一离心管，4℃保存。+22μLSDS、2μL的蛋白酶K翻转混匀（动作要轻）→55℃水浴>2h→存-20℃用于同工酶实验2.4%浓缩胶的配制（两组公用量）双蒸水/mL6.2mL0.5mol/LTris·HCl（pH6.8）/mL2.5mLAcr/Bis（30%）/mL3mLTEMED/μL20μL10%Aps/μL50μL总体积/mL1

8、0mL加入两玻璃夹缝中，并在两玻璃板夹缝中水平插入梳子，待凝胶后小心拔出梳子（在缓冲液中拔梳子）。5．电泳：4℃冰箱中，100v。（接近完成时配染色液！）6.停止电泳:指示剂溴酚兰移至底部约0.5cm时，切断电源。7.染色：小心从玻璃