实验 0Y 果蝇遗传标记分析-PAPD.ppt

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1、实验0Y果蝇遗传标记分析-PAPD一、实验目的：1.掌握RAPD分析基本方法技术;2.了解分子标记的重要应用价值.二、主要内容：基因DNA提取PCR反应电泳电泳图谱的观察、分析助教：郑莹三、实验原理:RAPD:建立在PCR基础上的一种分子标记。模板高温变性→足够低的温度下（通常为36℃）与随机引物（一般10个bp）退火→PCR→电泳如果两个退火位点足够近（200-2000bp左右）、分别位于互补的DNA链上，可以通过PCR扩增出DNA片段。引物结合位点DNA序列的改变以及两扩增位点之间DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异，

2、经电泳分离后通过EB染色以检测DNA片段的多态性。若位点2处碱基发生改变，则四、实验材料-步骤:（1）D.Virilis------------10只（2）黑腹果蝇--P♀、P♂、F1♀、F1♂、F2♀、F2♂各40只（3）其他材料--0.2g1份（7种果蝇样品+1种其他）/小组（1）、（2）的P、（3）由教师提供，（2）F1、F2用自己存的材料。已经制备匀浆液,一半已经用于同工酶实验制备DNA粗提液：每份材料（普通果蝇40只、大果蝇10只、或其他材料0.2g）+400μL匀浆缓冲液匀浆匀浆液200μL匀浆液200μL用于RAPD实验提取DNA（

3、冰浴操作）液体倒入1.5ml离心管+22μLSDS、2μL的蛋白酶K翻转混匀（动作要轻）→55℃水浴>2h→存-20℃用于同工酶实验已完成第一周做到此步一周后的实验课及课余时间:-20℃中取出的样品+RNA酶至200μg/mL，37℃0.5~1h等V酚/氯仿/异戊醇（25﹕24﹕1）抽提(慢慢旋转混匀，倾斜使两相接触面增大)冰浴10min4℃12000rpm离心5min1.5ml新EP上清（水相）至等V氯仿/异戊醇（24﹕1），轻混匀冰浴10min4℃12000rpm，5min1.5ml新EP上清（水相）至等V异丙醇，轻轻混匀白色线团状物4℃12

4、000rpm，5min弃上清为省时老师代做此步70%酒精洗涤4℃12000rpm，5min弃上清+100μlTE溶解室温干燥（不要太干，否则DNA不易溶解）0.6%Agarose电泳检测DNA质量(免)2.RAPD反应1‘．在0.2mlPCR管中配制25μl反应体系（2次）随机引物1μldNTPMixture2μlTaq酶0.2μl10×PCRbuffer2.5μlddH2Oupto24μl全班一人负责配齐（此配方×64，见下页）每桌一人领取16份样品所需量平均配给两组各组等分8份分别加8种样品的模板DNA各1μl随机引物64μldNTPMixt

5、ure128μlTaq酶12.8μl10×PCRbuffer160μlddH2Oupto1536μl（即1.536mL）反应体系64倍量（除模板外）：2’．在PCR热循环仪中进行如下反应：94℃200s→94℃60s→36℃60s→72℃120s40个循环→72℃(300s--600s)尽量成批与老师约时间3．电泳2%琼脂糖凝胶电泳，观察比较不同品系或同一品系亲子代间的条带的不同，并照相记录。操作分工技术问题注意事项助教指导：注意听实验作业（写在实验记录本上）：1.简述RAPD的实验原理、解决的问题；2.将你的实验结果画（剪贴）在记录本上，标出样

6、品名称、差异条带等；你的实验结论是什么？补充知识（课后阅读）：RAPDRFLPAFLPSTRSNP利用10个碱基的一个或几个随机引物非定点地扩增DNA片段，一般一个引物可扩增6-12条DNA片段，利用凝胶电泳分开扩增的片段，从而进行基因多态性研究。RAPD是一种能快速进行基因多态性研究的技术，并且由于不涉及印迹杂交、放射性自显影等技术，因此简便易行。RAPD是英文RestrictionFregrmeatLengthPo1ymor—Phism的缩写，意思是“限制性片段长度多态性”。RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生

7、突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多态性），多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。所用的探针为来源于同种或不同种基因组DNA的克隆，位于染色体的不同位点，从而可以作为一种分子标记(Mark)，构建分子图谱。RFLP扩增片段多态性“AFLP”续：由于变异、进化，一种引物可以使某一品系的DNA片段复制（扩增），而不能使另一品系的DNA片段复制（扩增）。电泳分离：同一引物扩增品系1品系2引物如：EcoRI和MseI相关引物短

8、串联重复序列STRs(shorttendemrepeats,mini-satellites)STR广泛存在于人基因组，占约5%，基本单位