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时间:2020-04-09
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1、实验0X果蝇变异的遗传标记实验——同工酶凝胶电泳(教材实验18,p85-89)一、实验目的:掌握同工酶分析的方法技术理解同工酶分析的遗传学意义二、主要实验内容:凝胶制备→提取酶液→活性电泳→染色分析助教:郑莹三、实验原理:同工酶(isozymes)是指催化反应相同,但结构和理化性质不同的一族酶。是受遗传体系决定的酶的不同分子形式。利用电泳分离(根据分子量、电荷)专一底物和特殊染料染色进行分析。配制分离胶(7.5%)(两组的量):双蒸水/mL9mL1.5mol/LTris·HCl(pH8.8)/mL5mLAcr/Bis(30%)/mL
2、5mLTEMED/μL20μL10%Aps/μL100μL总体积/mL20mL同台两组共用一电泳槽。注入两玻璃夹缝中,胶面上加1cm蒸馏水(自然凝胶后倾出)。为节省时间,先做:架好胶板电泳原理介绍教师分头指导操作应用:遗传育种2)基因定位……酯酶(Est):催化酯类化合物水解的酶系.乳酸脱氢酶(LDH):催化乳酸脱氢反应的酶.过氧化物酶(PO):催化过氧化物水解本次实验涉及:LDH染色原理乳酸丙酮酸LDHNAD+NADHNBT(黄)NBTH(蓝紫)PMS(氢递体)Est染色原理酯的水解产物与偶氮化合物(如坚牢蓝RR盐)结合产生红褐色
3、物质.PO染色原理H2O2被PO水解,此过程中染料联苯胺显色(蓝褐色).PO染色示意LDH4LDH3LDH5LDH1LDH2LDH电泳结果实例(1)D.Virilis------------10只(2)黑腹果蝇--P♀、P♂、F1♀、F1♂、F2♀、F2♂各40只(3)其他材料--0.2g四、实验材料:1份(7种果蝇样品+1种其他)/小组(1)、(2)的P、(3)由教师提供,(2)F1、F2用自己存的材料。已配制的各种试剂:1.组织匀浆液:100mmol/LNaCl-10mmol/LTris·HCl(pH8.0)-25mmol/LE
4、DTA(pH8.0)1).5mol/LNaCl2).0.5mol/LTris·HClpH8.03).0.5mol/LEDTApH8.02.1.5mol/LTris·HClpH8.8(4℃存放)3.0.5mol/LTris·HClpH6.8(4℃存放)4.30%Acr/Bis:29.2gAcr+0.8gBis→双蒸水定容至100mL→过滤→4℃存放5.上样缓冲液:0.25%溴酚蓝-40%(W/V)蔗糖水溶液6.电泳缓冲液(室温):5×:Tris7.5g+Gly36g→双蒸水溶解定容至500mL。使用时稀释至1×——老师配好。要求自配[
5、都做Est。7种样品点完剩余的3孔点普通果蝇、大果蝇、其他,用于LDH(背讲台组)、PO(面讲台组):醋酸а-萘酯240mg→溶于12mL丙酮中监牢蓝RR盐240mg→溶于12mL丙酮中→加216mLpH7.0磷酸缓冲液*两者完全溶解后把前者倒入后者中,迅速搅拌均匀,避光过滤。*pH7.0磷酸缓冲液(250mL):10.9gNa2HPO4溶于152.5mL水中,3.0gNaH2PO4溶于97.5mL水中,二者混匀。Est染液(第一桌配,240mL,均分给各组(30mL×8))7.染色液(电泳即将结束时配制完成)配制、染色要避光染色约
6、20分钟。LDH染液[第2桌配,60mL]:NAD+30.0mgNBT(氯化硝基四氮唑蓝)18.0mgPMS(吩嗪二甲酯硫酸盐)1.2mg乳酸钠0.7g0.5mol/LTris·Cl(pH7.1)4.4mL(老师提供)0.02gNaCl蒸馏水55.6mL染色约20分钟。PO染液[第3桌配,60mL]联苯胺1.0g冰乙酸9.0mL水36mLA液5.4mL30%H2O20.6mL水54mL溶,可研磨A液混合成为染色液染色5~10分钟,水洗停止反应。1.提取酶液五、方法步骤(合理分工、协调时间)每份材料(普通果蝇40只、大果蝇10只、或其
7、他材料0.2g)+400μL匀浆缓冲液匀浆匀浆液200μL匀浆液200μL用于RAPD实验提取DNA(冰浴操作)4℃,10000rpm,10分钟液体倒入1.5ml离心管液体倒入1.5ml离心管移上清于另一离心管,4℃保存。+22μLSDS、2μL的蛋白酶K翻转混匀(动作要轻)→55℃水浴>2h→存-20℃用于同工酶实验2.4%浓缩胶的配制(两组公用量)双蒸水/mL6.2mL0.5mol/LTris·HCl(pH6.8)/mL2.5mLAcr/Bis(30%)/mL3mLTEMED/μL20μL10%Aps/μL50μL总体积/mL1
8、0mL加入两玻璃夹缝中,并在两玻璃板夹缝中水平插入梳子,待凝胶后小心拔出梳子(在缓冲液中拔梳子)。5.电泳:4℃冰箱中,100v。(接近完成时配染色液!)6.停止电泳:指示剂溴酚兰移至底部约0.5cm时,切断电源。7.染色:小心从玻璃
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