植物过氧化氢酶的提取、活性测定及同工酶的凝胶电泳分析

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1、植物过氧化物酶的提取、活性测定及同工酶的凝胶电泳分析植物过氧化物酶的提取、活性测定及同工酶的凝胶电泳分析曾伟键广州大学生命科学学院生工1411414200023摘要：本实验从自备绿豆芽的上胚轴、下胚轴中分别提取出过氧化物酶，比较了两者的过氧化物酶的活性，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对两者的过氧化物同工酶进行初步研究。实验结果表明，豆芽不同部位的氧化物酶活性显著不同，蛋白含量也不同，同工酶谱不尽相同。关键词：过氧化物酶、活力测定、电泳、同工酶1、前言过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中。在有过氧化氢

2、存在时，过氧化物酶能使愈创木芬氧化，生成茶褐色物质，可用分光光度计测量生成物的含量。同工酶（ioszymes）是指作用于底物相似或完全相同的酶的不同分子形式，即催化同一种反应而结构不同的一族酶。它们是受遗传体系决定的酶的不同分子形式。利用凝胶电泳技术（PAGE）可以将它们分开。用专一的作用底物和特性燃料，把需要分析的酶染色，在胶柱子上呈现同工酶谱通过本实验掌握植物同工酶实验技术，了解植物同工酶分析在遗传学研究中的意义。着重掌握过氧化物酶的提取，电泳与染色技术和分析方法。2、材料与方法2.1实验材料

3、自备绿豆上胚轴、下胚轴2.2主要药品20mMKH2PO4、考马斯亮蓝试剂、愈创木芬、丙烯酰胺（Acr）、甲叉双丙稀酰胺（Bit）、过硫酸胺、蔗糖、溴酚蓝、联苯胺、过氧化氢2.3主要仪器与设备电子天平、冰冻高速离心机、分光光度计、DYY-6C型电泳仪（北京市六一仪器厂）、双垂直电泳槽DF-26A型（北京东方特力科贸中心）、注射筒及针头、微量注射器、研钵、秒表、试管及试管架、移液枪(0~200μL及0~1000μL)2.4试验方法2.4.1植物过氧化物酶的提取①取绿豆胚芽、胚轴各1g剪碎。②加入少许石

4、英砂和2mlKH2PO4，快速研磨，再加入5mlKH2PO4研磨，后加入离心管中；③匀浆液离心4500rpm10min。④离心过后，上清液即为酶粗提取液POD，将提取液定容到10ML,取5ml于零下20℃冷冻保存，作为电泳的POD样品，供测定。1/7CreatedbyTsangWaiKingon2015/12/30植物过氧化物酶的提取、活性测定及同工酶的凝胶电泳分析2.4.2考马斯亮蓝染色法测定样品中的蛋白质浓度考马斯亮蓝G-250在游离状态下乘红色，当它与蛋白质结合后乘蓝色，他的灵敏度高，反应十

5、分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定，在两分钟左右达到平衡，在595nm波长下有最大光吸收，其光吸收值与蛋白质含量呈正比。测定蛋白质浓度范围为01000μg/Ml,重复性好，精确度高，线性关系好，是常用的一种测定蛋白质浓度的方法。①标准曲线的绘制操作方法：取6支试管，按下表绘制标准曲线：试管编号0号1号2号3号4号5号0.1mg/ml标准蛋白溶液-0.20.40.60.81(ml)0.15mol/LNaCl(ml)10.80.60.40.2-考马斯亮蓝试剂/ml5ml摇匀，1h内以0号管为空白对

6、照，在595nm处比色A595nm0.6070.6470.6960.7550.8050.842以A595nm为纵坐标，标准蛋白质含量为横坐标，在电脑上绘制标准曲线。制作标准曲线回归方程：Y(含量)=aX(OD595值)+b，得出相关系数R2。②样品蛋白浓度的测定取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质的浓度取两支试管，按下表添加试剂，以0号管为空白试样，1、2号管为未知蛋白溶液试样，分别测量出其

7、吸光度值（1）试管编号0号1号2号（2）待测液(ml)-0.10.1（3）0.15mol/LNaCl(ml)10.90.9（4）考马斯亮蓝试剂(ml)5ml（5）摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色A595nm值0.6781.3450.7912/7CreatedbyTsangWaiKingon2015/12/30植物过氧化物酶的提取、活性测定及同工酶的凝胶电泳分析根据标准曲线的方程式，计算出样品的蛋白质含量。2.4.3植物过氧化物酶活性的测定（愈创木酚氧化比色法）过氧化物酶能使愈创木

8、酚氧化，生成茶绿色物质，可用分光光度计测量生成物的含量。①取出冰箱中备用的粗酶液，将分光光度计调到470nm；②取光径1厘米的比色杯2只；③对照杯加反应混合液2.0ml，KH2PO40.5ml，校零点。④样品管加入反应混合液2.0ml，酶提取液0.5ml，立即计时，每隔30秒计1次，共计min。⑤酶活力计算：酶活性（△470/minmg蛋白）＝每分钟OD变化值/mg蛋白（或鲜重）2.4.4植物过氧化物酶同工酶电泳技术同工酶（ioszymes）是指作用于底物相似或完全相同的酶的不同分