华中农业大学植物过氧化物酶同工酶测定-ct.ppt

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1、1实验08植物过氧化物酶同工酶测定（园盘式凝胶电泳法）一、原理聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在催化剂作用下聚合而成，具有三维网状结构，其网孔大小可由凝胶浓度和交联度加以调节。凝胶电泳兼有电荷效应和分子筛效应。被分离物质由于所载电荷数量、分子大小和形状的差异，在电泳时会产生不同的泳动速率而相互分离。2过氧化物酶是植物体内常见的氧化酶，植物体内许多生理代谢过程受其同工酶的种类及活性的调节。同工酶具有不同的迁移速度。将电泳后的凝胶置于含有H2O2及联苯胺的溶液中染色，利用过氧化物酶催化H2O2分解并把联苯胺氧化成蓝色或棕

2、褐色产物的原理，出现的蓝色或棕褐色条带即为过氧化物酶同工酶在凝胶中存在的位置，多条有色带即构成过氧化物酶同工酶酶谱。3二、材料、设备与试剂（一）实验材料：小麦芽。（二）设备：1.冷冻离心机；2.稳流稳压电泳仪；3.电泳槽（园盘型）等。（三）试剂1.分离胶缓冲液2.分离胶贮液：3.过硫酸铵：现配现用。44.四甲基乙二胺(TEMED)。5.电极缓冲液：Tris6.0g，Gly（甘氨酸）28.8g，用水定容至1000mL(pH8.3)，用前稀释10倍。6.3%H2O2。7.联苯胺染色母液：联苯胺1g+冰醋酸18mL+H2O2mL溶解后贮于棕色瓶中。8.同工酶

3、染色液：配后立即使用。取0.5mL联苯胺母液+9.3mLH2O+0.2mL3%H2O2。5三、实验步骤（一）过氧化物酶的提取（二）电泳槽的安装（三）分离胶的配制先准备约6支干燥、洁净的玻璃管，将下端用堵头封闭，防于试管架上备用。按分离胶缓冲液∶分离胶贮液∶H2O∶过硫酸铵溶液=1.5mL∶3mL∶1.5mL∶6mL的比例吸取各溶液至小烧杯中，然后加入一滴四甲基乙二胺（TEMED），混合均匀，用尖嘴滴管灌吸取混合好的胶液并灌注到玻璃管中，直至胶液至玻管的刻度线处(如有气泡应设法排除)，然后沿玻管内壁在胶面上缓慢加注0.5cm的水层，约30min左右，当见

4、到水层底下有一清楚界面时，表明胶已聚合。倒去水层，或用滤纸条吸干水分。（四）点样（五）电泳6（六）剥胶电泳完毕，将电泳槽取出，倒去缓冲液，取下凝胶管，放入培养皿中。用一个带有长针头的注射器，吸满水，将针头沿管壁插入，同时慢慢地将注射器中的水推出，并不断转动凝胶管，将凝胶管挤脱出来。（七）染色取0.5mL联苯胺母液+9.3mLH2O+0.2mL3%H2O2，混匀后倒入盛有凝胶条的培养皿。此时可以看到胶条上出现蓝色或棕褐色环，即过氧化物酶酶带，约10min后用自来水冲洗，此时蓝色带会慢慢变为棕褐色条带。7四、结果用尺子量出各酶带和溴酚蓝的迁移距离，计算各同

5、工酶的迁移率，并划出同工酶图谱。28S18S