5'RACE 操作步骤

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1、5'RACE操作流程一、提总RNA二、合成第一条cDNA链1、加如下组分于一0.5ml离心管（或PCR管）中，混匀ComponentAmountGSP1...................................................................2.5pmoles(~10to25ng)DEPC-treatedwater.....................sufficientforafinalvolumeof15.5μl(orsterile,distilledw

2、ater)2、70°C孵育10min，冰浴1min，短暂离心后依次加入下列组分ComponentVolume(μl)10XPCRbuffer.......................................................................2.525mMMgCl2...........................................................................2.510mMdNTPmix.............

3、...........................................................10.1MDTT.................................................................................2.5finalvolume.............................................................................8.5Thefinalvolum

4、eofstep1and2is24μl.3、轻轻混匀，短暂离心，42°C孵育1min4、加1μlSuperScript™IIRT，轻轻混匀，42°C孵育50min反应体系最终组成如下:20mMTris-HCl(pH8.4)50mMKCl2.5mMMgCl210mMDTT100nMcDNAprimer(GSP1)400μMeachdATP,dCTP,dGTP,dTTP1-5μg(~40ng/μl)RNA200unitsSuperScript™IIRT5、70°C，15min终止反应6、离心10-20s后将反应

5、体系至于37°C下7、加1μlofRNasemix，轻柔充分混匀，37°C孵育30min8、短暂离心聚集反应液，置冰上三、S.N.A.P柱纯化回收cDNA1、室温下，bindingsolution平衡柱子2、每份待纯样品分装~100μlDEPC-treatedwater，65°C预热备用3、加120μlbindingsolution(6MNaI)于thefirststrandreaction中4、将cDNA/NaIsolution转至S.N.A.P柱，13,000xg离心20s5、取出离心柱，将离心液转至

6、一小离心管中保存，知道确保成功回收到cDNA。把纯化柱再放回收集管中。6、加0.4mlCOLD(4°C预冷的)1Xwashbuffer于离心柱中13,000xg离心20s倒掉离心液，如此再重复洗三次7、加400μlCOLD(4°C预冷的)70%乙醇于离心柱中13,000xg离心20s倒掉离心液，洗两次8、13,000xg离心1min除去残余乙醇9、将纯化柱转至一新回收管中，加入50μl65°C预热DEPC-treatedwater13,000xg离心20s收集洗脱出的cDNA四、cDNA加尾1、在一PCR

7、管中加入以下组分，并轻轻混匀ComponentVolume(μl)DEPC-treatedwater.......................................................................................6.55Xtailingbuffer.....................................................................5.02mMdCTP.....................

8、........................................................2.5S.N.A.P.-purifiedcDNAsample....................................................................................10.0finalvolume..............................