《race操作步骤》.doc

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1、StorageConditionsStoreControlHumanPlacentalTotalRNAandSMARTerIIAOligonucleotideat–70°C.StoretheNucleoTrapGelExtractionKitatroomtemperature.Storeallotherreagentsat–20°C.IMPORTANT:PriortocDNAsynthesis,pleasemakesurethatyourRNAisintact完好的andfreeofcontaminants(seeSectionV.C.Asses

2、singtheQualityoftheRNATemplate).Donotchangethesize(volume)ofanyofthereactions.Allcomponentshavebeenoptimizedforthevolumesspecified.1.10µl体系，PCR管冰上配制，混匀并瞬时离心，室温放至第7步2.0µl5XFirst-StrandBuffer1.0µlDTT(20mM)1.0µldNTPMix(10mM)4.0µl总体积2.新PCR管分别混匀以下试剂5'-RACE-ReadycDNA3'-RACE-ReadycD

3、NA1.0–2.75µlRNA*1.0–3.75µlRNA*1.0µl5'-CDSPrimerA1.0µl3'-CDSPrimerA3.加无菌水至3.75µl加无菌水至4.75µl4.混匀并瞬时离心混匀并瞬时离心5PCR仪：72℃3min，42℃2min，瞬时离心14000g，10s（12000rpm，10s）.6.5'-RACE-ReadycDNA每反应加1.0ulSMARTerⅡAoligo7.4.0µlBufferMixfromStep10.25µlRNaseInhibitor(40U/μl)1.0µlSMARTScribe™Reverse

4、Transcriptase(100U)5.25µl总体积8.5'-RACE3'-RACE5.25ulMasterMixfromstep⑦5.25ulMasterMixfromstep⑦4.75µl5'RACEcDNAfromstep⑥4.75ul3'-RACEcDNAfromstep⑤10µl总体积10µl总体积9.轻轻吸打混匀，并瞬时离心10.PCR仪：42℃90min11.PCR仪：70°C10min.12.稀释反应产物：用Tricine-EDTAbuffer如果起初的总RNA≤200ng，则加20µl进行稀释如果起初的总RNA≥200ng，

5、则加100µl进行稀释（本试验采用的100µl稀释）如果起初用的是PolyA+RNA，则加250µl进行稀释13.稀释后的样品可以放-20℃保存（保质期3个月）VI.RapidAmplificationofcDNAEnds(RACE)cDNA末端快速扩增（RACE）1.PCR管，50µl体系，冰上混匀以下试剂：34.5µlPCR-GradeWater5.0µl10XAdvantage2PCRBuffer1.0µldNTPMix(10mM;inSMARTerRACEorAdvantage2PCRKit)1.0µl50XAdvantage2Polym

6、eraseMix41.5µl总体积2.枪头轻轻吸打混匀，无气泡，瞬时离心3.5’-RACEPCR体系：5’-RACE-ReadycDNA2.5ulUPM(10*)5.0ul5’RACE引物（10µM）1.0ulMasterMix41.5ul总体积50.0ul吸打混匀，瞬时离心3’-RACE-ReadycDNA2.5ulUPM(10*)5.0ul3’RACE引物（10µM）1.0ulMasterMix41.5ul总体积50.0ul吸打混匀，瞬时离心4.PCR反应（热启动）：94℃5min94℃30s61℃40s自己设计的引物的温度72℃3min24

7、0cycle72℃10min4℃10h⑤PCR产物可以-20℃保存第二轮PCR或巢式PCR1.将第一轮PCR产物用Tricine-EDTA稀释50倍(吸取第一轮PCR产物5.0µl，加到245µl的Tricine-EDTABuffer中，将剩余的-20℃保存)2.混匀以下试剂PCR-GradeWater36ul10XAdvantage2PCRBuffer5.0uldNTPMix（10mM）1.0ul50XAdvantage2PolymeraseMix（5U/ul）1.0ul稀释50倍的PCR产物5.0ulNUPPrimer（10uM）1.0ul5

8、’或3’RACE引物(10uM）1.0ul总体积50ul枪头吸打混匀，瞬时离心。3.PCR反应（热启动）：94℃5min94℃30s57