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《人淋巴细胞趋化因子真核表达质粒构建及体外转染生物学活性测定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、·196·第18卷第3期医学研究生学报Vol.18No.32005年3月JournalofMedicalPostgraduatesMar.2005·论著·人淋巴细胞趋化因子真核表达质粒的构建及体外转染的生物学活性测定鲁雄兵,周四维,杨为民,宋晓东,罗刚,孙凯,曹正国(华中科技大学同济医学院附属同济医院泌尿外科,湖北武汉430030)摘要:目的:构建人淋巴细胞趋化因子(HLptn)真核表达质粒,在膀胱肿瘤细胞株BIU287中表达重组质粒,并检测趋化活性。方法:用RT2PCR法自活化的人外周血淋巴细胞扩增H
2、Lptn含编码区序列的cDNA,克隆至pGM2TEasyT载体,测序正确后,将目的片段插入pcDNA3.1(+)载体,获得阳性克隆pcDNA3.1(+)2HLptn;用脂质体介导其转染BIU287细胞,用Western2blot检测转染后细胞中HLptn的表达;取转染后的上清液,采用Boyden小室法检++测表达的HLptn趋化CD4、CD8T淋巴细胞的生物学活性。结果:克隆的cDNA序列与GenBank中U23772的序列编码区内第225位碱基不同,系同义突变,构建了真核重组表达载体pcDNA3.1(
3、+)2HLptn;转染的BIU287细++胞表达HLptn,其培养上清对CD4、CD8T淋巴细胞具有趋化活性。结论:成功构建的HLptn真核表达系统可在人膀胱肿瘤细胞株BIU287中表达。关键词:淋巴细胞趋化因子;克隆;真核表达3中图分类号:Q782文献标识码:A文章编号:100828199(2005)0320196204Constructionofhumanlymphotactineukaryoticexpressionvectoranddetectingofchemotacticactivityaf
4、terbeingtransfectedinvitroLUXiong2bing,ZHOUSi2wei,YANGWei2min,SONGXiao2dong,LUOGang,SUNKai,CAOZheng2guo(DepartmentofUrology,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,Hubei,China)Abstract:Objective:Toconstruc
5、taneukaryoticexpressionvectorcontaininghumanlymphotactin(HLptn)cDNAandtoexpressitinhumanbladdercarcinomacell(BCC)lineBIU287anddetectchemo2tacticactivity.Methods:HLptncDNAwasamplifiedbyRT2PCRfromstimulatedhumanperipheralbloodmononuclearcellsandclonedtovec
6、torpGM2TEasy.Afterconfirmingthesequence,thecDNAwasinsertedintopcDNA3.1(+)andthepostiveclonepcDNA3.1(+)2HLptnwasobtained.Therecombi2TMnantplasmidwastransfectedintoBIU287cellswithLipofectamine2000andtheexpressionwasdetected+byWesternblot.Itsculturesupernat
7、antswereusedtochemotaxisassayofHLptnattractingCD4Tcells+andCD8TcellswithBoydenChemotaxisChamber.Results:ThesequenceofclonedHLptncDNAwasdifferentfromNO.U23772atNo.325baseinORF,itwassamesensemutation;Mammalianrecom2binantexpressionplasmidpcDNA3.1(+)2HLptnw
8、asconstructed;ItcanexpressinBIU287withLipo23收稿日期:2004210221;修订日期:2004211209基金项目:国家自然科学基金资助项目(批准号:30271300)作者简介:鲁雄兵(19732),男,湖北仙桃人,主治医师,医学博士研究生,从事膀胱肿瘤免疫治疗研究。第3期鲁雄兵,等人淋巴细胞趋化因子真核表达质粒的构建及体外转染的生物学活性测定·197·TM++fectamine2000.Itsc
