资源描述：
《小鼠趋化因子cxcl10真核表达载体的构建 》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、小鼠趋化因子CXCL10真核表达载体的构建【摘要】应用RT-PCR方法，从小鼠脾脏T细胞的mRNA中，扩增获得编码小鼠趋化因子CXCL10的cDNA，并加上人单核细胞趋化蛋白1的信号肽基因，将其克隆到Pucm-T载体，经酶切及测序鉴定，进而构建CXCL10重组真核表达载体。采用脂质体法体外转染COS-7真核细胞，经inEM无血清培养液中混匀，室温放置45min后，加入800μlOpti-Mem无血清培养液，使终体积为1ml。缓慢加入已接种COS-7细胞的六孔培养板，边加边摇动，37℃、5%CO2培养4h后弃混合液，加入完全培养液继续培养。另设转染空载体pcDNA3.1(+)
2、的细胞和未转染细胞作对照组。1．3．2in后垂直电泳。用半干式转移法将蛋白转移到PVDF膜上，脱脂牛奶封闭，加兔抗鼠CXCL10多克隆抗体（1：1000），4℃过夜，TTBS洗3遍，再用HRP标记的抗兔二抗（1：1000）室温下孵育1.5h，TTBS洗3遍，DBA显色。1．3．3转染细胞表达CXCL10的趋化活性检测细胞上清参考Xia等〔7〕的方法测定趋化指数。分离小鼠脾细胞，尼龙毛柱分离T细胞，调整细胞浓度为2×106/ml，趋化池下层的复孔加入各组细胞上清或鼠重组CXCL10细胞因子，上层加入40μl的淋巴细胞悬液，37℃、5%CO2培养3h，显微镜下计数5个高倍视野，
3、趋化指数=实验孔中迁移的细胞数/对照孔中迁移的细胞数，趋化指数＞2认为对淋巴细胞有趋化作用。2结果2．1CXCL10真核表达载体构建脾脏细胞总RNA经逆转录巢式PCR二次扩增后，琼脂糖凝胶电泳可见一条约300bp条带（图1）。两步PCR反应后电泳，第二次PCR产物含信号肽序列，比第一次PCR略长，约370bp（图2）。将扩增片段与T载体连接、转化后，酶切及测序鉴定正确。由于扩增片段两端的酶切位点为EcoRⅠ和HindⅢ，而片段本身也含有一个HindⅢ位点，且T载体本身也有这两个酶切位点，酶切后片段较多，但仍可回收正确的目的片段（图3）。与经同样酶切的pcDNA3.1(+)连
4、接后反向测序鉴定，表明CXCL10基因加上了人单核细胞趋化蛋白1的信号肽序列，有EcoRⅠ和HindⅢ的酶切位点，且mCXCL10基因序列与Genebank所示一致，说明所构建的真核表达载体正确。2．2转染细胞表达CXCL10蛋白的检测采用,LiuMT,etal.IFN-gamma-inducibleprotein10(CXCL10;CXCL10)-deficientmicerevealaroleforCXCL10ineffectorTcellgenerationandtrafficking.JImmunol,2002,168:3195.2LiuY,HuangH,Saxen
5、aA,etal.Intratumoralcoinjectionoftors.CancerGeneTher,2002,9:533.3GieseNA,RaykovZ,DeMartinoL,etal.SuppressionofmetastatichemangiosarabyaparvovirusMVMpvectortransducingtheCXCL10chemokineintoimmunopetentmice.CancerGeneTher,2002,9:432.4ChenQR,KumarD,StassSA,etal.Liposomesplexedtoplasmidsencodi
6、ngangiostatinandendostatininhibitbreastcancerinnudemice.CancerRes,1999,59:3308.5SargentTD,YangM,BonnerJ.NucleotidesequenceofclonedratserumalbuminmessengerRNA.ProcNatlAcadSciUSA,1981,78:243.6Mined,1993,178:1057.
