c57bl6小鼠mhci分子真核表达载体的构建

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1、优秀毕业论文天津医科大学硕士学位论文中文摘要目的：构建C57BL／6小鼠MHC．1分子真核表达质粒，转染293T细胞并鉴定其表达，为研究分子嵌合诱导移植免疫耐受奠定基础。方法：①采用反转录PCR(reversetranscriptionPCR，RT-PCR)方法获取供体C57BL／6小鼠MHC．I基因H．2D6和H．2K6。②通过双酶切、定向克隆技术将H．2Do和H．2K6克隆入真核双表达质粒plRES，构建重组质粒plRES．H2Db-H2K6。③使用Lipofectamine2000将重组质粒转染293T细胞，同时设置未转染组，

2、转空质粒组。④荧光实时定量PCR检测转染后各组H．2Do和H．2Ko在mRNA水平表达情况。⑤流式细胞术检测转染后各组H一2Do和H一2K6在蛋白水平表达情况。结果：①成功获取C57BL／6小鼠MHC．1分子H．2D6及H．2K6的等位基因。②构建的C57BL／6小鼠MHC．1分子真核表达质粒经限制性双酶切鉴定成功正向插入plRES质粒载体，经测序分析，克隆的基因与GenbankC57BL／6小鼠H．2D6和H．2K6基因序列完全相同。③使用脂质体法成功将重组质粒plRES．H2Db_H2Ko转染293T细胞。与未转染组和转染空质粒

3、组相比，转染重组质粒组H．2Do和H．2K6基因mRNA表达分别增加632倍和904倍，差异有统计学意义(P<0．01)。而未转染组与转染空质粒组之间差异无统计学意义(胗o．05)。④转染重组质粒组H一2D6和H．2K6基因蛋白表达分别为(24．50±】．88)％和(34．30±2．68)％，明显高于转染空质粒组【H．2D6(O．42±0．05)％；H一2Ko(0．12±0．03)％]及未转染组fH．2Db(O．38±O．03)％；H一2K6(O．10±0．02)％】，差异具有统计学意义(尸<0．01)，而转染空质粒组和未转染组之间

4、蛋白表达水平差异无统计学意义(Jp>0．05)。结论：成功构建C57BL／6小鼠MHC．1分子真核双表达载体NRJ三S—H2Db-H2Kb，并实现其在293T细胞中的表达。关键词：MHC—1分子双表达质粒分子嵌合293T细胞精品参考文献资料优秀毕业论文AbstractObjective：ToconstructeukaryoticexpressionvectorofC57BL／6mouseMHC—IinordertotransfectC57BL／6mouseMHC．Igenesinto293Tcellandassayitsexpres

5、sionandtolaythefoundationforinvestigateingmolecularchimerisminducingtransplantationimmunetolerance．Methods：①C57BL／6mouseMHC．IgenesH一2DoandH一2K6wereamplifiedbyRT-PCR．②H．2D6andH．2K6genesWereclonedintoeukaryoticdoubleexpressionplasmidplREStoconstructrecombinateplasmidplRE

6、S-H2DKH2K6．③Therecombinateplasmidwastransfectedinto293TcellwithLipofectamine2000，anon—transfectedandanemptyplasmidtransfected293Tcellwerecontrolgroups．@Real．timefluorescencequantitativeRCRwasusedtoconfirmthemRNAexpressionofH-2D6andH。2K6．@ProteinexpressionofH一2DoandH-2K

7、“wasassayedbyflowcytometry．Results：①C57BL／6mouseMHC—IgenesH一2DoandH一2K6weresuccessfullygainedbyRT-PCR．②TherecombinateplasmidplRES．H2Db-H2Kowasconfirmedbyrestrictiondoubleenzymesdigestionandsequenceanalysis．③TherecombinateplasmidWassuccessfullytransfectedinto293Tcellwit

8、hLipofectamine2000．@Comparedwiththenon-transfectedgroupandtheemptyplasmidtransfectedgroup，theexpressionofH-2DoandH·2K