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1、重组人促红细胞生成素的制备及临床应用司叫卜喊叫喊叫卜洲卜书日卜卜日卜叨卜竺主竺色重组人促红细胞生成素的制备及临床应用徐志利中国药科大学生物化学研究室,摘要本文介绍用中国仓鼠卵巢细胞生产重组人促红细胞生成素该细胞,株稳定且表达效率高的理化及生物学性质与人尿的促红细胞生成素无差别临床应用其治疗肾性贫血有较好的疗效。对非肾性贫血的治疗也有良好前景。关键词重组人促红细胞生成素肾性贫血非肾性贫血。,主要是肾细胞产生的一种造血激病人的治疗大量的临床试验证明,,
2、素是由个氨基酸残基组成的分子量为不仅对肾性贫血病疗效好对非肾性贫血也。的糖蛋白其生理作用是通过它与,有良好的治疗前景是抗贫血药研究中的新一。幼红细胞集落形成单位或其早幼进展一阶段的红细胞系爆裂形成单位的的制备,受体结合并促进其向红细胞前体网织红细,〔,。胞和原红细胞分化最后生成红细胞〕人基因组文库的克隆人染色体组的。基因以单拷贝形式首先制备寡核昔酸探针从再生障碍性,,出现于一区域存在于一个贫血病人的尿中分离出测定其氨基端一,,一的
3、!班限制性片段中后者编码一段序列对应氨基端一的一一一一个氨基酸顺序的信号肤及个氨基酸和的。一一一一组成的分子量为的成熟蛋白质实验序列分别合成它们的个,、分析证明这种蛋白质含有键和个寡核昔酸片段用噬菌体多核昔酸,,一键糖基化部位及两个二硫键且蛋白质只激酶和」在’端接上以标,。有糖基化才有生物活性闭,。记的残基构成混合的放射性探针叫,当人的肾功能发生严重损害时如在急用常规方法
4、〔幻与构建人胎肝、,性慢性肾衰竭或肾切除情况下的产基因组文库后,用上述探针在硝酸纤维素膜,。生减少出现贫血因此对绝大多数上。,进行噬斑杂交选出阳性克隆并对其。肾性贫血病人均有很好的疗效在基因重组,片段进行限制图谱和序列分析含有全,技术诞生以前主要从贫血症患者的尿。部基因的重组即为目的克隆和绵羊血中提取,得率非常低,且极不稳携带人基因表达质粒的构建,,定圈理化和生物性质难以测定亦无法大规将上述得到的人基因组序列的。!。模应用年人基因克隆和表达的限
5、制性片段凝胶电泳纯化用〔,,成功〕使的制备成为现实年,聚合酶处理成平齐末端并将具有位。。美国已批准的临床试用日本点的接头连接到平齐末端上然后用连接酶,也批准几个药厂上市主要用于肾透析贫血的限制位点将其插入到质粒药学进展年一卷第期,一〔,〕。,上即完成重组质粒的构建选择性地吸附于上用一系列的缓冲。,,是人工构建的表达型质粒它含有液洗脱最后用的醋酸缓冲液洗脱、,一增强子序列腺病毒型主要晚期启收集再
6、用柱将其,。一·一动子和三邓前导顺序将在纯化得到的高纯度。中克隆用氯化艳等密度离心分。一离发现长度大约为高效液相色谱分离纯化也是一种行之有。,哺乳动物细胞的转染效的方法闭富集培养细胞用溶菌酶和,,最常用的宿主细胞为中国仓鼠卵巢去垢剂处理破碎细胞后以离,,,细胞闭细胞株具有稳定的染色心上清液用盐酸肌溶液处理最后用。,体组型最近日本开发了一种人的淋巴母细反相纯化
7、流动相为乙〔,〕‘,,胞株细胞作为宿主细胞还有猴醇和为得到的。肾细胞和幼年仓鼠肾细胞等选择哺乳动物比活为,,,需要适当其它纯化方法如综合分离法按操作顺细胞生产是因为的糖、一、,序包括!∀层析基化包括末端唾液酸基化以表达其生物活乙醇沉淀,一、「uoroeaex性因此不能应用基因工程中常用的大Slfppylsphd层析凝胶过滤和经,肠杆菌和酵母等宿主,因其没有恰当的糖基基磷灰石柱层析等也能得到7000Ou/mg.。,oA
8、b化系统不过等人最近用杆状的rhEPO此法与M亲和层析和高效液,,病毒表达系统生产了具有生物活性的相色谱分离法相比操作步骤多rhEPO易,,,,融合蛋白【川。被酶降解而降低收率因此在操作之前需。〔
