重组人促红细胞生成素的分离纯化工艺

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1、26重组药物作者：周雅丹本章目录26.1重组药物概述26.2重组药物的通用制造方法与技术26.3重组药物的分离纯化技术关键26.4重组药物的质量控制26.5典型重组药物制造技术及工艺26.1重组药物概述20世纪70年代建立的DNA重组技术带来了生物技术新的变革，促进了以基因工程技术为核心的现代生物技术的诞生和发展，被认为是20世纪人类的一项最伟大的贡献。DNA重组技术，亦称基因重组技术，是指将DNA片段（如基因）按人们的设计方案定向地与载体相连，并转入特定的受体细胞，构建成工程菌（或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因

2、在工程菌内进行复制和表达的技术。应用DNA重组技术表达和生产的多肽或蛋白质类药物，称为重组药物。26.1重组药物概述应用DNA重组技术可大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽，提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理生化及结构等进行深入的研究和开发应用，还可以对已有的药物进行改造，克服其不足，创造自然界不存在的全新物质。目前，采用DNA重组技术生产的药物主要有干扰素、生长素、胰岛素、重组疫苗等。重组药物制造的通用方法流程为：①获得目的基因；②将目的基因和载体连接，构建DNA重组体；③将DNA重组体转入宿主菌构建工程菌；④工程

3、菌的发酵；⑤外源基因表达产物的分离纯化；⑥产物的检验和制剂制备等。26.2重组药物的通用制造方法与技术对于各单元操作可参考前面各章节叙述，在操作过程中需注意：1、操作条件要温和，能保持目的产物的生物活性；2、选择性要好，能从复杂的混合物中有效地将目的产物分离出来，达到较高的纯化倍数；3、收率要高；4、两个技术之间要能直接衔接，不需要对物料加以处理调整，这样可以减少工艺步骤；5、整个分离纯化过程要快，能够满足高生产率的要求。重组药物分离纯化的一般流程为：固液分离、细胞破碎、提取、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工等

4、。26.3重组药物的分离纯化技术关键构建好的基因工程菌在适当条件下培养发酵，表达重组药物后，还需选择适当的分离纯化方法将产物提纯，制成特定的制剂，才能被应用于临床。重组药物结构上多为活性肽或蛋白质，稳定性差，对pH、温度、金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等十分敏感，容易失活、变性。而且基因工程菌培养发酵产物中含有大量的细胞、代谢物、残留培养基、无机盐等，而目的产物在初始物料中含量较低，同时重组药物一般都需注射给药，对其质量、纯度要求高，如需无菌、无热源等。为获得合格的目的产物，必须建立与上述特点相适应的分离纯化工艺。分离纯

5、化重组药物须重点考虑下列几个技术因素：1.产物的表达形式2.根据蛋白产物性质选用适宜的层析类型3.分离单元之间的衔接4．分离纯化工艺的要求1.产物的表达形式根据外源基因表达产物在宿主细胞中的定位，可将表达方式分为分泌型表达和胞内表达。外源蛋白的分泌表达是通过将外源基因融合到编码信号肽序列的下游来实现的。将外源基因接在信号肽之后，表达产物在信号肽的引导下跨膜分泌出胞外，同时在宿主细胞膜上存在特异的信号肽酶，它识别并切掉信号肽，从而释放出有生物活性的外源基因表达产物。分泌型表达产物的发酵液的体积很大，但浓度较低，因此必须在纯化前富

6、集或浓缩，通常可以用吸附、沉淀或超滤的方法来进行富集或浓缩。如果表达产物前没有信号肽序列，它可以可溶形式或不可溶形式（包涵体）存在于细胞中。对于胞内产物，首先要通过离心或过滤的方式收集细胞，并采用适当的方法破壁。在工业生产中常用大肠杆菌作为宿主菌来生产目的蛋白，在大肠杆菌中当外源蛋白的表达量达到20%以上时，它们一般就会以包涵体（inclusionbody）的形式存在。外源蛋白的复性是利用包涵体获得外源蛋白最关键也是最复杂的一步。重组蛋白的复性操作主要有两种方法：一种是将溶液稀释，导致变性剂的浓度降低，促进蛋白质复性。如果蛋白

7、质以胞内可溶表达形式存在，则收集菌体后破壁，离心取上清液，然后用亲和层析或离子交换法进行纯化。在纯化过程中还常采取适当的保护措施，如低温、加入保护剂、尽量缩短纯化工艺及时间等措施来防止产物的降解和破坏。另外表达产物还可存在于大肠杆菌细胞周质中，这是介于细胞内可溶性表达和分泌表达之间的一种形式，它可以避开细胞内可溶性蛋白和培养基中蛋白类杂质，在一定程度上有利于分离纯化。大肠杆菌经低浓度溶菌酶处理后，可采用渗透冲击的方法来获得周质蛋白。缺点是渗透冲击的方法破壁不完全，产物的收率较低。2.根据蛋白产物性质选用适宜的层析类型基因工程产

8、物常需采用层析来进行精制以达到药用标准。在选择层析类型和条件时要综合考虑蛋白质的性质。如蛋白质的等电点和表面电荷的分布及目的蛋白质的稳定性。亲和层析是一种高效的分离纯化手段，不同的蛋白质可以选用不同的特异性亲和配基，如酶和底物、抗原与抗体、糖链和凝集素等。一般是目的蛋白与配基