重组人红细胞生成素生产工艺

《重组人红细胞生成素生产工艺》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、第一节概述第二节工程CHO细胞系的构建第三节CHO细胞系培养过程与工艺控制第四节分离纯化工艺第十八章重组人红细胞生成素生产工艺概述18.1.1红细胞生成素的种类18.1.2红细胞生成素的临床应用18.1.3红细胞生成素的理化性质18.1.4红细胞生成素的表达研究红细胞生成素第一节概述概述18.1.1红细胞生成素的种类红细胞生成素1、天然红细胞生成素的生成和作用原理1890：现象，低氧压下红细胞增多1948：Bonsdorff和Jalavisto，提出红细胞生成素（erythropoietin，EPO）动脉氧分压是EPO生成调节因素概述红细胞生成素

2、2、天然红细胞种类1971年：从贫血羊血桨中分离出羊EPO1977年：从再障碍贫血患者的尿液中分离纯化出人EPOhEPO形式：hEPO-α及hEPO-β，二者氨基酸组成及顺序相同，165aa，活性类似糖基化及其含量不同：EPO-α含有较多的N-乙酰葡萄糖，总含糖量比EPO-β高。概述红细胞生成素3、红细胞生成素的生理作用红细胞生成素，又称促红细胞生成素，或红细胞生成刺激因子：调节红系祖细胞，对红细胞生成有特异性刺激作用的细胞因子。EPO与靶细胞结合：骨髓、脾、肝细胞等，促进前体细胞增殖和分化，生成RBC概述红细胞生成素4、重组人红细胞生成素第一代

3、：两种，天然基因表达，rhEPO-α和rhEPO-β1989：Amgen,Epogen；1990，Biotech，ProcritrhEPO-α，CHO细胞生产Roche，NeoRecormon(rhEPO-β)，BHK细胞系概述红细胞生成素4、重组人红细胞生成素用基因工程技术生产的人红细胞生成素第二代：EPO突变体2001，Amgen，Arasnep长效rhEPO-α突变体，170aa，有5个N糖基化位点唾液酸残基高2倍，半衰期36h（EPO为4-8h）CHO细胞系生产概述红细胞生成素适应症：各类贫血起因：慢性肾衰竭、AIDS、肿瘤、化疗等引起的

4、贫血开发新的临床适应症：肾病和糖尿病在生物制品中排位NO.1，2004年全球销售额11.9BUSD，重磅炸弹药物各类体育竞技中，禁止使用的药物？18.1.2红细胞生成素的临床应用概述红细胞生成素大小：166aa糖链占分子量的39%糖基化程度与准确性对活性影响很大pI4.2～4.6，对热和pH变化相对稳定。18.1.3红细胞生成素的理化性质概述红细胞生成素天然提取制药工艺：由再生障碍性贫血患者的尿液中纯化而得，人源的红细胞生成素。产量极其有限。（未用生产）基因工程制药工艺：重组人红细胞生成素（应用生产中）化学制药工艺：基于红细胞生成素的受体，研究与

5、红细胞生成素功能相当的化学药物（开发中）18.1.4红细胞生成素的表达研究概述红细胞生成素重组人红细胞生成素工艺路线的研究SV40病毒启动子驱动表达载体，在COS-1中瞬时表达红细胞生成素昆虫SF9细胞中杆状病毒系统表达rhEPO。产率有所改善，但糖基化程度较小干扰素-α基因启动子的rhEPO表达载体，BALL-1细胞，产生较高量的rhEPO概述红细胞生成素重组人红细胞生成素工艺路线的研究大肠杆菌中表达，仅具有体外抗原结合活性。家蚕体内的表达系统，糖基化简单，药物在体内稳定性较低、活性较差等问题。在CHO、BHK细胞系统中稳定表达，获得的重组红细

6、胞生成素与天然红细胞生成素相似。现在工业生产中多采用动物细胞培养表达红细胞生成素进行大规模生产。第一节概述第二节工程CHO细胞系的构建第三节CHO细胞系培养过程与工艺控制第四节分离纯化工艺第十八章重组人红细胞生成素生产工艺红细胞生成素第二节工程CHO细胞系的构建细胞系的构建18.2.1表达载体的构建18.2.2转染18.2.3稳定性筛选红细胞生成素细胞系的构建18.2.1表达载体的构建人红细胞生成素基因的克隆策略：从基因组中克隆编码区片断，拼接成全长；或从基因中克隆全长，在动物细胞中转录出mRNA，RT-PCR克隆全长序列将目标基因与载体在连接体

7、系中连接过夜，连接酶为PhageT4连接酶表达载体的构建：人红细胞生成素基因与载体进行酶切、连接、转化、大肠杆菌中筛选、鉴定、测序、确证序列、方向无误。红细胞生成素细胞系的构建细胞培养：CHOdhfr-60%汇合；用无血清培养基洗涤3次脂质复合物制备：细胞载体prEPO和pDHFR与脂质体混合共感染：与无血清培养基混合，加到培养皿中，37℃，5%CO2，4h抗性克隆的获得：在相关的培养基中培养后进行抗性筛选18.2.2转染红细胞生成素细胞系的构建18.2.3稳定性筛选胰蛋白酶消化，1:5稀释，在含有1nmol/LMTX培养基上培养，3－4d更换培

8、养基，培养10～14天，至抗性克隆出现。传代培养：1:5稀释，按1nM→5nM→25nM→100nM→200nM→1000nM使MTX浓