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《研究重组人促红细胞生成素一级结构》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、第7.卷分析化学（0+:AB>C?AC+）#研究报告第’期########################$%%8年’月<*DEFGFH;I)E6J;K?E6JLMDN6J<*FODGM)L’("P’(2"!!!!!!!"!!研究报告!!"!!!!!!!"基质辅助激光解吸附电离!飞行时间串联质谱研究重组人促红细胞生成素一级结构"$""""卢庄#王杉#代景泉#王京兰#张养军#应万涛$"$#"徐友宣#钱小红#吴侔天#蔡耘"（军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京"%%&’%）$（国家体育总局运动医学研究所兴奋剂检测中心，北京"%%%$(）摘#要#建立了
2、生物质谱研究)*+,-一级结构的系列方法，包括分子量、唾液酸含量以及!!糖含量等糖基化性质的测定方法，并用于.种国产)*+,-样品的分析；在此基础上优化酶切条件，使测定的肽质量指纹谱（,/0）的覆盖率均达到(&1，成功鉴定了.个样品中的全部!!糖基化位点以及对分子中两对二硫键进行了结构确证，测定.个样品分子量分别为：$22’.3"4$23.56、$2(."3.4$73$56、$28&$3’4$$3%56和$2(".324$$3’56；唾液酸含量分别为：’3%1、.3&1、’381和’3.1；糖含量分别为：7.371、7.321、7.3"1和7.981
3、。此外还对.种产品在"!连接糖型及!!连接糖型上的区别做了初步探讨。关键词#基质辅助激光解吸附电离!飞行时间串联质谱，重组人促红细胞生成素，肽质量指纹谱，二硫键，!!连接糖基化位点，糖型结构!"引""言促红细胞生成素（+,-）是一种糖蛋白，绝大部分由肾脏产生，少量来自肝脏（胎儿及新生儿则主要［"］由肝脏产生）。其最主要的功能是促进红细胞的生成，提高机体血红蛋白的浓度，临床上主要用于治疗肾性贫血和一些并发性贫血。"(&&年出现了与天然+,-活性几乎相同的重组+,-（)*+,-）产品，它能够改善机体携氧能力，增强人体耐力，因此，很快就成为一种应用广泛的生
4、物工程药物。有些运动员将其作为兴奋剂使用。研究表明，+,-!!糖基化程度对+,-的体内活性有相当大的影响。!!糖基化不完全的)*+,-体外活性正常，而体内活性则降低到体外活性的"@’%%，其体内被清除的速率也明显［$］降低。+,-属于内源性物质，正常人体液中含量很低，半衰期短。)*+,-与内源性+,-的氨基酸序［7］列完全相同，仅糖基部分有微小的差别。)*+,-比天然+,-含有更多的三天线及四天线低聚糖，并［.，’］且二者在唾液酸化程度上有明显的差别。由于)*+,-糖基化性质与)*+,-的生物学功能关系密切，且是内源性+,-与外源性+,-的区别所在，
5、因此，作为生物工程药物的)*+,-其一级结构的确证，具有重要意义。本研究应用生物质谱对.种国产)*+,-进行了一级结构分析，建立了一系列生物质谱研究)*+,-多种糖基化性质的方法，如平均分子量、糖含量、唾液酸含量的测定以及!!糖基化位点的鉴定等，结合酶学和生物质谱的技术方法测定了肽质量指纹谱图（,/0），经过对酶切方法的优化，使.种产品,/0的覆盖率均达到(&1。在此基础上，对)*+,-结构中的两对二硫键进行了研究，确定了二硫键位置的结构信息，并对!!糖链及"!糖链的结构做了初步探讨，本方法灵敏度高，重现性好，为生物工程产品的质量控制提供了一种可行的
6、方法。#"实验部分#3!"仪器与试剂#$%%’!%7!$7收稿；$%%’!"$!$’接受本文系国家自然科学基金（:;3$%$2’%..，$%$2’%.8）、国家重点基础研究发展规划（:;3$%%.<=’$%&%$，$%%"<=’"%$%"）、北京市科技计划重大项目（:;3>%7%$7%$&%"(%）和奥运科技专项课题（:;3$%%$=?(%.=%"，$%%7=?(%.=%’）资助项目VTQ分析天平
7、，超纯水由?*..*$&%(纯水系统（美国?*..*$&%(公司）制备。乙腈（@2AB级，美国CD9D6,E(%公司）；三氟乙酸（9F5）和碘乙酰氨（*&G&,+(’,)*G(，比利时5B8:3公司）；二硫苏糖醇（>99，G*’H*&’H%(*’H&.，美国2%&)(I,公司）；蛋白内切酶1.JB和肽!K糖苷酶F（2L1,M(F，美国371?5公司）；唾液酸酶（!K<（KN，O，P，Q）KL(J%,)*-*G,M(）及其缓冲液（美国3*I),公司）；!K氰基K!K羟基肉桂酸（@BB5，美国371?5公司）；=)&.RA9%*MK@B.$@PD#（美国
8、;36公司）；0*$’*$B=（P美国?*..*$&%(公司）；L,@<2:!、L,<@2:!及脲为国产分析
