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1、第31卷分析化学(FENXIHUAXUE) 研究报告第2期2003年2月ChineseJournalofAnalyticalChemistry148～152丽春红G用于人血清样品中总蛋白的共振光散射测定3杨传孝 李原芳 黄承志(西南师范大学环境化学研究所,重庆400715)摘 要 在酸性介质中,丽春红G(PonceauG,PG)与牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、溶菌酶(Lys)及γ2球蛋白(γ2IgG)等蛋白质作用产生共振光散射(RLS)增强信号,最大散射峰位于288nm处。在最佳酸度和离子强度下,增强RLS强度在288nm处与蛋白
2、质的浓度呈线性关系,用于测定BSA、HSA、Lys、γ2IgG的检出限均在25μgPL以下。本方法成功地应用于合成样和人血清样品的测定,测量结果与考马斯亮蓝法一致。关键词 共振光散射,丽春红G,蛋白质1 引 言1,2共振光散射技术研究是目前超分子化学及其分析应用研究中比较活跃的课题之一。应用该技3,45～78,9术已建立了测定核酸和蛋白质的分析方法,表征了分子聚集的光谱特征和核酸的超螺旋结81011构。目前该技术已用于痕量金属离子、表面活性剂的测定。研究表明:增强RLS信号与蛋白质6的分子量大小和电性有关。在静电作用为主的体系中,当溶液的pH小于
3、蛋白质的等电点时,蛋白质带正电荷。阴离子染料与蛋白质之间通过静电作用形成蛋白质2染料的复合物,亦即染料在蛋白质上堆积形成较大的粒子,因而产生强烈的RLS增强信号。与静电作用相比,电荷偶合产生的RLS增强就复6杂得多,但在以电荷偶合为主要作用的环境条件下,会出现RLS响应与蛋白质分子量成正比的情况。丽春红G是一种组织学对比染料,含有两个磺酸基,弱酸条件下带负电荷,因而易与带正电荷的大分子作用。2 实验部分2.1 仪器与试剂F22500荧光分光光度计(日本日立公司),UV28500紫外分光光度计(香港天美公司),MVS21旋涡混合器(北京北德科学仪器有
4、限公司),PHS23C酸度计(上海大中分析仪器厂)。牛血清白蛋白(BSA,上海长阳生化制药厂),人血清白蛋白(HSA,美国Sigma公司),溶菌酶(Lys,中国科学院上海生物化学研究所东风生化技术公司)、α2糜蛋白(Chy,美国Sigma公司)、γ2球蛋白(γ2IgG,德国Serva公司)、胃蛋白酶(Pep,北京芳草医药工业研制公司)、纤维素酶(Cel,中国科学院上海生物化学研究所东风生化技术公司)。除γ2IgG的配制需加入少量0.1molPLNaCl溶液助溶外,其他蛋白质贮备液均是直接将蛋白质溶于适量的二次蒸馏水配制成,并保存于0～4℃的冰箱中。
5、所有蛋白质的操作溶液的浓度均为25mgPL。丽春红G(PonceauG,PG,上海试剂三厂),操作溶液的浓度为:1.5×-4-510molPL。考马斯亮蓝G2250(CBBG2250,Fluka进口分装),操作溶液浓度为:1.2×10molPL。Britton2Robinson(BR)缓冲溶液(pH3.80),应用0.05molPLNaCl溶液控制离子强度。使用二次蒸馏水,试剂均为分析纯。2.2 实验方法-4在10mL的比色管中加入1.0mLBR缓冲溶液和适量的1.5×10molPL的PG溶液,0.8mL0.05molPL的NaCl溶液。旋涡混合后
6、加入适量的蛋白质溶液,再旋涡混合并用二次蒸馏水稀释至刻度,混匀后于荧光光度计上(λem=λex)进行同步扫描获得RLS光谱,在λem=λex=288nm处测定RLS强度。荧光分光光度计的激发和发射狭缝始终保持在5nm。2002203206收稿;2002210228接受本文系国家自然科学基金(20275032)、教育部优秀青年教师基金(2000211)和重庆市应用基础研究资助项目第2期杨传孝等:丽春红G用于人血清样品中总蛋白的共振光散射测定1493 结果与讨论3.1 光谱特征图1是PG、BSA和PG2BSA的RLS光谱图,PG、BSA在220～600
7、nm范围内共振光散射信号极弱;而在该波长范围内,PG和BSA组成的复合物却有较强的RLS增强信号,最大散射峰位于288nm处,表明PG和BSA发生了作用,PG在BSA上通过静电作用堆积而成较大的颗粒,从而产生了增强的RLS光谱,且RLS强度随BSA浓度的增加而增强,并在一定的浓度范围内呈线性关系。3.2 条件优化3.2.1PG的最佳浓度BSA浓度一定时,改变PG的浓度,其复合物的RLS强度开始随PG的浓度的增-5加而增强,到PG的浓度为1.5×10molPL时,RLS强度达到最大,然后又随PG的浓度的增加而减少(图2),这是因为随着PG浓度的增加,
8、RLS强度增加的同时,体系对散射光的吸收也增加的结果。PG与其他蛋白质作用时,PG浓度也有类似的影响。 图1PG与BSA作
