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《凡纳滨对虾G 蛋白G q 基因的克隆和功能鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、凡纳滨对虾G蛋白Gq基因的克隆和功能鉴定11,211,31叶志云,金利华,邹海鹰,骆晶晶,林圣彩(1.厦门大学生命科学学院,福建厦门361005;2.厦门大学材料学院生物医学工程研究中心,福建厦门361005;3.加拿大阿尔伯特卡尔加里大学生物化学与分子生物学系,加拿大)摘要:为了寻找并克隆凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)G蛋白亚基,为研究对虾的生理调控提供理论基础,通过简并PCR和RACE反应获得目的基因的全长cDNA序列;用Blast,DNAstar和Genedoc软件对所得序列进行分析,确定所得序列为凡纳滨对虾
2、G蛋白Gq基因,命名为pvGq。将该基因的编码序列克隆到表达载体,通过免疫共沉淀实验和胞内Ca2+,IP3浓度的测定鉴定该Gq亚基的功能,发现该亚基的序列和功能与其他Gq家族成员具有高度保守性。用Westernblotting分析发现pvGq在对虾身体各部位存在普遍分布,尤其在脑神经、眼柄、腮和颚片中有大量表达,在嗅觉器官触角也有适量分布。说明了pvGq在对虾生命活动中的重要性,为研究对虾的生理调控奠定了理论基础。关键词:G蛋白;克隆;凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)中图分类号:Q78文献标识码:A
3、文章编号:10003096(2008)08006406凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)是世界养列设计一对简并引物,正向引物序列为5AGCACI殖产量最高的三大虾种之一。该品种原产于美洲太(AT)T(ACT)(AG)TIAA(AG)CA(AG)ATG3,平洋沿岸水域。自1988年引入我国后,国内科学工反向引物序列为5TTGAA(AG)CA(AGCT)TG作者就它的生活习性、育苗、养殖、抗病等方面做了(AGT)ATCCA(CT)TT3。引物由上海生工生物大量研究。但是从分子生物学的角度去研
4、究凡纳滨工程服务有限公司合成。25L简并PCR反应体系对虾的生长、发育等调控机制的报道还很少见。如下:上述第一链cDNA1.5L,10mol/L的两向很多实验表明,G蛋白在无脊椎动物(包括美国简并引物各2L,10mmol/L的dNTP0.6L,Taq龙虾Homarusamericanus)的嗅觉和视觉信号途径DNA聚合酶(宝生物工程(大连)有限公司)[1~3]中起着极其重要的作用。而气味、光线、食物等1.25U,10缓冲液2.5L,超纯水16.2L。PCR因素在对虾等低等生物的生活习性中都是很重要的扩增程序为:94!变性3mi
5、n;94!变性30s,42!退因素。因此,作者主要寻找并克隆对虾G蛋白信号火60s,72!延伸60s,循环40次;最后72!延伸途径中的功能基因G蛋白亚基,并就该亚基的结3min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,回收目的片段构和功能进行分析,旨在为对虾的生长、发育、抗病DNA并克隆到pBluescriptSK()载体,由上海生工及养殖等生理调控提供一定的理论基础。测序。1材料和方法1.3快速扩增cDNA末端反应1.1总RNA的提取和cDNA的合成快速扩增cDNA末端反应(RapidAmplificationofcDNAEnds,RAC
6、E)。上述克隆的测序结果通过体长8cm左右的凡纳滨对虾购自厦门大学白NCBI网站Blastx软件比对,初步确定为目的基因城菜市场。将活体对虾的脑神经迅速取出,用后,根据片段序列设计两条特异引物分别进行5端和RNeasyminikit试剂盒(美国Qiagen公司)提取总3端RACE反应。进行5端RACE反应的引物序列RNA,操作过程见试剂盒说明书。RNA经1.0%琼为5CTCATAGTCCACCGCTCGCACCAGAT3,进脂糖凝胶电泳,溴化乙啶染色鉴定,260nm处测定RNA吸光度。取总RNA2g,用SMARTRACEcD
7、NAAmplificationKit试剂盒(美国Clontech公收稿日期:20050927;修回日期:20080515司)合成第一链cDNA。操作过程见说明书。基金项目:国家863计划资助项目(2002AA629060)1.2简并PCR作者简介:叶志云(1962),女,广西南宁人,高级工程师,学士,主要从根据已知其他物种G蛋白亚基的高度保守序事生物化学研究,电话:05922182993,Email:yzy1893@xmu.edu.cn64海洋科学/2008年/第32卷/第8期行3端RACE反应的引物序列为5ATGA
8、T30min。再用HEPES缓冲液(HEPES10mmol/L,CAGGGCCATGGACCTTCTTCAA3。RACE反Na2HPO41mmol/L,NaCl137mmo
