具有分泌蛋白能力短芽孢杆菌筛选及鉴定

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1、!"卷#期微生物学报&’()!"0’)#"$$"年%"月!"#$%&"’()&(*(+&"$,&-&"$*+,+-.+/"$$"!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!具有分泌蛋白能力的短芽孢杆菌的筛选及鉴定"彭清忠张惟材朱厚础（军事医学科学院生物工程研究所北京%$$$3%）摘要：短芽孢杆菌（!"#$%%&’()*+$’）具有分泌蛋白能力强和胞外蛋白酶活性低的特性，是分泌表达外源蛋白较理想的宿主。为获得分泌表达系统较理想的宿主菌，建立了短芽孢杆菌高效筛选模型，从1$$余株细菌中筛得1株具有高蛋白分泌能力且没有胞外蛋白酶活性的

2、候选菌。经多相分类学初步鉴定其中6株为短芽孢杆菌。关键词：短芽孢杆菌，筛选，鉴定中图分类号：72858文献标识码：9文章编号：$$$%5#"$2（"$$"）$#5$#285$3分泌表达作为蛋白质的一种表达形式具有以下优势：产物一般可溶、可正确折叠、有生物活性；毋需破碎细胞，使工艺简化；表达产物与胞内蛋白分离，利于纯化。现有原核分泌表达系统并不尽如人意。大肠杆菌遗传背景清楚，分子克隆操作技术成熟，但在进行外源蛋白高效表达时易形成包涵体；产物分泌表达水平低，且常常分泌至周质空间而不是真［%］正的胞外。枯草杆菌具有良好的分泌性和非致病性，但胞外蛋白酶活性较高，易引起产［"，8］［!，6］物降解

3、。短芽孢杆菌（!"#$%%&’()*+$’）不仅分泌蛋白能力强而且胞外蛋白酶活性低，具有分泌表达外源蛋白的天然优势，利用它们可望建立一个高效的原核分泌表达系统。为获得分泌表达系统较理想的宿主菌，本研究组建立了短芽孢杆菌的高效筛选模型，从不同来源的样本中筛选到1株分泌蛋白能力强的细菌，且没有检测到胞外蛋白酶活性。根据形态学、细胞脂肪酸组成分析和%#:/;09序列特异性引物<=;检测等方法，初步鉴定其中的6株为短芽孢杆菌。!材料和方法!"!材料!"!"!菌株及培养条件：短芽孢杆菌9:%>%1!（69?==1"!#）和9:%>28%购自中国普通微生?物菌种保藏中心，枯草杆菌==?==9@2"$

4、#1和%3$$"%由军事医学科学院微生物流行病研究所杨瑞馥教授惠赠，大肠杆菌*A6!和BC%$2为本室收藏，其他菌株系本课题从土壤［#］中分离得到；短芽孢杆菌培养用?培养基，枯草杆菌和大肠杆菌等其他菌株培养用D@"培养基。!"!"#试剂：菌种筛选用试剂：6E的高氯酸，6E和%$E的三氯乙酸（?=9），干酪素，可溶性淀粉，小牛血清白蛋白（@:9），碘溶液（FG5G）。革兰氏染色试剂见文献［#］。细胞脂肪""军事医学科学院创新课题启动基金资助课题（$$%$$%1）作者简介：彭清忠（%23$4），男，湖南慈利县人，军事医学科学院生物工程研究所助理研究员，博士，主要从事微生物遗传学研究。收稿日期

5、："$$"5$%5"6，修回日期："$$"5$!5%3FJ7微生物学报76卷酸组成分析试剂见文献［!］。"#$反应所用试剂和核酸%&’()’购自*&+&$&公司。!"#菌种的筛选!"#"!分泌蛋白能力强的细菌的筛选：从北京、河北等地采集土样，分别置于含,-.无菌水的大试管中沸水浴/0-12，然后吸取上清涂布于.3琼脂平板，405培养至长出菌落。把具有代表性的菌落从.3平板中挑于两个*琼脂平板，405培养678，然后用,9的高6氯酸覆盖其中的一个平板，静止/0-12后用涂棒刮开各菌落，观察菌落底部和周围是否有混浊圈。将有混浊圈产生的细菌于另一*琼脂平板中做好标记。6将初筛的细菌接种至*液体

6、培养基，405震荡培养6:。离心取上清液于/;,-.离心6管中，加入等体积的/09*#<，混匀后室温放置40-12，离心观察是否有大量沉淀生产。取有大量沉淀产生的细菌上清液60进行=>=?"<@A电泳。另外，以3=<作为标准蛋白，!.［E］用.BC’D法测定上清液中蛋白含量。!"#"#细菌胞外蛋白酶和淀粉酶活性分析：将所筛分泌蛋白能力强的细菌接种于含0;,9干酪素的*6琼脂平板，405培养6:后用,9*#<覆盖平板，观察菌落周围是否出现透明圈；将没有透明圈产生的细菌接种至含0;,9可溶性淀粉的*琼脂平板，405培养6:6后用碘溶液覆盖平板，观察菌落周围是否有无色透明圈显现。!"$菌种的鉴

7、定［F］!"$"!革兰氏染色和电镜观察：取不同生长时期的细菌菌液进行革兰氏染色，于光学显微镜下观察菌体染色结果。用/9G6=H（7IGF;E）对所筛菌株进行负染，于G"#%/60型透射电镜下观察菌体形状及大小。［!］!"$"#细胞脂肪酸组成分析：根据皂化作用提取细菌细胞脂肪酸甲酯，于G"FEJ0型气相色谱仪上进行分析。利用%K>K系统软件（4;6），将细胞脂肪酸甲酯的峰形图与各微生物的模式图进行比较分析以鉴定细菌的分类地位。!"$"