降解豆粕抗原蛋白的兼性厌氧型芽孢杆菌筛选及鉴定-论文.pdf

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1、华达小肽专栏圆降觎豆粕抗原蛋白硇兼性厌蠡型小肽轰家技术论l云芽孢杆菌筛选及鉴定美国华达生f科技莆隙公司张莉力许云贺田玉民苏玉虹中田广州拽术中心华达生化(湖北)有限公司Add：广州市天河龙口西路Add：武汉市洪山区I狮北路2号辽宁医学院帝量广蜗B座20A樱花大厦A座'5楼Tel：020—3846598838465977Tel：027-8787855687878557Fex：O2O—38465977Fax：O27—87878559PC：51C630PC43。o72wwwvRechusaCOWlE—maiI：huadshd03070sinaco

2、rn摘要从长期存放的陈旧豆粕、自然发酵豆粕及豆豉等样品中分离并筛选出l株降解大豆抗原蛋白且高产蛋白酶的兼性厌氧型芽孢杆菌，经培养特征、形态观察、生理生化试验和16SrDNA序列分析，鉴定为枯草芽孢杆菌，将其命名为BacillussubtilisXZ35。关键词芽孢杆菌豆粕大豆抗原蛋白中图分类号：S816．3文献标志码：B文章编号：1002—2813(2013)01—0034—03豆粕中存在多种抗营养因子，大部分抗营养因1：20(质量／体积，mL)料液比浸提。37℃下，子耐热性差，加热可以除去，但是大豆抗原蛋白是180r／min提取1h，取

3、出，将pH值调回8．8。再置一种热稳定性好的抗营养因子，其过敏反应可以引摇床180r／min提取1．5h，8000r／min离心20rain，起仔猪腹泻。目前微生物发酵法是去除这种抗营养取上清并调pH至4．0，上清浑浊，4000r／min离因子的主要方法之一。心5rain，弃去上清。用蒸馏水溶解沉淀，调pH至研究以陈旧生豆粕、自然发酵豆粕和散装豆豉7．2，加葡萄糖2．5、NaC10．2、K，HPO0．5和为菌源，利用大豆抗原蛋白制备培养基筛选可降解MgSO4·7H200．2g，加蒸馏水定容至1000mL，大豆抗原蛋白且高产蛋白酶的芽孢杆菌

4、，并对其进加琼脂15g，115℃灭菌20min。3)种子培养基：行菌种鉴定，以期为发酵豆粕的生产及微生态制剂葡萄糖10、蛋白胨5、酵母膏5、KHPO1、Mg．的研制提供优良的菌种。SO40．2和Na2CO310g，加蒸馏水定容至1000mL，1材料与方法调节pH至7．2。4)复筛培养基：豆粕在粉碎机中粉碎1rain，加入1％葡萄糖，按料水比1：1加无菌1．1试验材料水，pH自然，115oC灭菌20rain。样品：饲料厂长期存放的陈旧生豆粕、采集自1．2方法不同产地的自然发酵豆粕粉和散装豆豉。豆粕：购1．2．1样品的预处理及富集培养自锦州某

5、饲料厂。取25mL样品置于装有225mL无菌氯化钠注射培养基：1)富集培养基：牛肉膏3、蛋白胨液的三角瓶中，80℃水浴振荡20rain，杀死营养细10和NaC15g，加蒸馏水定容至1000mL，pH7．2。胞，然后取8mL样液接人装有100mL富集培养基2)初筛培养基(以大豆抗原蛋白为唯一氮源)：粉的三角瓶中，37恒温培养箱中富集培养24h。碎过60目筛的豆粕样品5g，以0．03mol／LpH8．81．2．2富集培养液的稀释的Tris—HC1缓冲液(含0．0lmol／L亚硫酸钠)按将富集培养后的样液按照10倍梯度稀释法稀释至0．000l倍

6、。收稿日期：2012—．10—．301．2．3降解豆粕抗原蛋白菌株的初筛基金项目：辽宁医学院产学研合作项目；辽宁医学院博士科研分别取0．01、001和0．000l倍稀释液各Q1mL启动基金项目(Y20I1B11)通信作者：苏玉虹涂布于以豆粕抗原蛋白为唯一氮源的初筛培养基平34饲料研究FE)REs鞋Alc}{NOOI23华达小肽专栏板上，37℃培养24h，挑选出现蛋白溶解圈且呈现征的菌株，编号XZ1～308，．然后将各菌株接人牛不同菌落形态的革兰阳性菌接人牛肉膏蛋白胨固体肉膏蛋白胨培养基斜面上，置于37cIC培养箱中培斜面培养基中，置于37

7、℃培养箱中培养24h，放入养24h，放入4℃冰箱中保藏，待进一步复筛。4℃冰箱中保藏，待进一步复筛。2．2高产蛋白酶菌株的复筛1．2．4高产蛋白酶菌株的复筛将初筛获得的并可降解大豆抗原蛋白的芽孢杆将初筛获得的并可降解大豆抗原蛋白的芽孢杆菌308株，接种l环于种子培养液中，37℃恒温培菌菌株，接种1环于种子培养基中，37℃恒温培养养箱内培养24h，然后按照l0％的接种量将种子培箱内培养24h，然后按照l0％的接种量将种子培养养液接种至装有豆粕培养基的平皿中，利用平皿做基接种至装有豆粕培养基的平皿中，37℃发酵2d。豆粕固态发酵试验，37cI

8、=发酵2d，发酵结束后，发酵结束后，以蛋白水解度作指标进行复筛，筛选以蛋白水解度做指标获得26株蛋白水解度大于25％出降解大豆蛋白能力强的芽孢菌。的芽孢杆菌，其中XZ35菌株水解度最高，为29