细胞核的分离与核酸的鉴定

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1、实验6细胞核的分离与核酸的鉴定（Separationofcellnucleiandidentificationofnucleicacids）遵义医学院生化教研室1.掌握离心技术的原理及离心机的使用；2.熟悉提取分离细胞核、细胞质的方法；3.熟悉鉴定核酸的方法；一、核酸的种类及其分布请思考？DNA、RNA在细胞中的分布：DNA胞核内(98%)胞质内(2%)RNA胞核内(10%)胞质内(90%)核酸的种类：DNA、RNA结论：DNA主要存在于细胞核，RNA主要存在于细胞质。二、分离细胞质与细胞核１.破碎细胞

2、细胞破碎的方法机械法高速组织捣碎机玻璃匀浆器研钵物理法超声匀浆器冻融法化学法自溶法酶处理表面活性剂处理法利用各细胞器在一定介质中的沉降速度的差异，可采取离心的方法，将细胞器分离出来。２.离心技术细胞器沉降先后顺序先后是细胞核、线粒体、溶酶体和其他微体、核糖体和大分子。离心方法差速沉降离心法速率区带离心法等密度区带离心法密度梯度区带离心法√√差速沉降离心法(differentialcentrifugation)采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒，在不同的离心速度及不同离心时

3、间下分批分离的方法。加速低速高速差速沉降离心法一般用于分离沉降速度相差较大（一般为10倍）的颗粒。缺点：①分离效果差，不能一次得到纯颗粒；②壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高时，在离心管一侧会出现沉淀；③颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗粒变形、聚集而失活。每种纯样品成份在介质溶液中的沉降速度可以表为：V=d2÷18×(σ-s)÷η×ω2r。V：是某一时刻样品的沉降速度（厘米/秒）；d：样品颗粒的直径（厘米）；σ：样品颗粒的密度（克/厘米3）；s：介质溶液的密度（克/厘米3）；η：介质溶液的

4、粘性系数（克/厘米·秒）；ω：离心机重轴的旋转角速度（1/秒），ω=2πN÷60，N：转/分；r：颗粒所在位置与旋转轴心之间的距离，即离心半径（厘米）；密度梯度离心法的理论依据待分样品的沉浮行为如何确定？当σ>S时V>0即样品顺离心力方向沉降σ

5、质中进行离心，在一定的离心力下根据颗粒的沉降速度不同最后分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。此法用于分离具有一定沉降速度差的颗粒（沉降速度差为20%或更少）或分子量相差3倍的蛋白质。适用于分离密度相似而大小有别的样品。样品在密度较高、密度梯度较为陡峭的介质溶液中进行离心，具有不同密度的颗粒向上浮起，一直移动到与它们的密度相等的等密度点的特定梯度位置上，形成几条不同的区带，这就是等密度区带离心法。等密度区带离心法此方法适用于分离大小相近而密度不同的样品。优点：a.分离效果好，可一次获得较纯

6、颗粒。b.适应范围广,能象差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒,又能分离有一定浮力密度差的颗粒。c.颗粒不会挤压变形。缺点：a.离心时间较长；b.需要制备梯度；操作严格，不易掌握。密度梯度区带离心法(densitygradientcentrifugation)三、核酸的鉴定核酸核苷酸磷酸碱基戊糖定糖法（戊糖的差异）（1）核糖核酸的鉴定浓HCl＋3H2O+β－D－核糖糠醛糠醛3，5－二羟基甲苯绿色化合物RNAＯＨˉ水解β－D－核糖地衣酚法:（2）脱氧核糖核酸的鉴定DNAＨ＋水解β－D－２－脱氧核糖-H2

7、O硫酸脱氧核糖ω－羟基－γ－酮基戊醛蓝色化合物二苯胺法:（1）分离细胞质与细胞核（1）分离细胞质与细胞核（2）核酸的鉴定实验流程图0.5g肝组织＋少许石英砂研磨加5ml的1.5%柠檬酸溶液，研磨，双层纱布过滤肝匀浆，倾入离心管离心：3000r/min；10′上层液沉淀加入1ml0.25mol/L蔗糖柠檬酸溶液核悬液沿壁缓铺于8ml0.88mol/L蔗糖柠檬酸液面上离心：2000r/min；5′上层液（弃去）沉淀核洗液5ml洗涤沉淀，离心：2000r/min，5′上层液（弃去）沉淀初步纯化的细胞核5ml0

8、.02mol/LNaOH溶解细胞核待测样品鉴定地衣酚法二苯胺法编　号12细胞质（滴）20-核　液（滴）-201mol/LKOH（滴）20202．鉴定：取试管三支，编号，按下表操作:编　　号123细胞质水解液（滴）20--核液水解液（滴）-20-5％三氯醋酸（滴）1010303,5一二羟基甲苯液（滴）3030301.水解：取离心管二支，编号，按下表操作：（2）核糖核酸的鉴定混合各管沸水浴(10′)冷却加入5%三氯醋酸(8ml)搅匀后离心200