发光法测定菌体ATP含量

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1、发光法测定菌体ATP含量1.实验目的2.实验原理3.试剂4.实验材料与仪器5.操作步骤及结果一.实验目的1.理解ATP的理化特性和生理功能;2.学会用荧火虫素-荧火虫素酶生物发光法定量测定ATP含量的方法;3.理解ATP生物发光原理及应用研究。二.实验原理生物发光(bioluminescence)在希腊语中表示活着的意思,在拉丁语中表示发光、发亮的意思。目前，生物发光应用最广最主要的是荧光素-荧光素酶反应发出的荧光，荧光素酶存在于荧火虫、水母一上些细菌中，它是生物内产生的一种生物反应蛋白质。1.ATP生物发光工作原理荧光素酶-ATP检测法，其化学反应的结果是把化学能转化为

2、光能。细胞内源性的ATP含量可以反应活细胞的数量和活性。其化学反应如下：ATP+D-L-Luciferin+O2→Oxyluciferin+AMP+ppi+O2+Light当细胞受损或死亡时，其ATP值迅速下降或消失，基于这一原理，检测细胞内的ATP含量，即可反应细胞的存活状况，ATP浓度与活细胞数密切相关。检测时先将ATP与提取剂充分混合，使细胞壁和细胞膜裂解，释放ATP，再加入荧光素-荧光素酶，ATP在荧光素和荧光素酶的作用下，使其释放磷酸基团同理发出荧光，用生物荧光仪检测相对荧光强度（relativelightunits,RLU）,由此测出ATP含量，进而反映活细胞

3、数。2.ATP生物发光特点优点：灵敏、快速、简便、稳定是ATP生物发光的主要优势所在，同时可以把ATP数量化，用荧光强度（RLU）把光定量，广泛应用于食品工业，医药，生物学等领域。缺点：荧光强度和菌落形成单位（CFU）之间没有直接关系，也无法对细菌的种属进行鉴定。3.应用研究检测环境是否被有害的微生物污染，食品卫生的检测和生产环境实时监测（HACCP）等。用于乳制品的检测、调味品如脱水蔬菜的细菌学的测定。新药筛选及疗效评价：广泛应用于需要进行大量快速初选工作的新药筛选中。细胞免疫活性检测应用：ATP生物发光法还可测定T细胞的免疫活性。三.试剂1.荧光素-荧光酶试剂将解冻后

4、的12mlReocnstiuttoinBueffr与荧光素酶-荧光素粉剂混合，轻轻摇晃（不能振荡）使其溶解。第一次使用前在室温下放置1h，以后只需20min左右。不用时要放置在-20ºC下保存。取0.5ml的标准ATP试剂（10-7mol/l）到5ml的容量瓶中，加入缓冲液定容，得到10-8mol/l的标准ATP试剂。用移液管取5ml的上述标准ATP试剂到50ml的容量瓶中，加入缓冲溶液定容，得到10-9mol/l的标准ATP试剂。重复以上过程，得到10-10mol/l和10-11mol/l的标准ATP试剂。2.标准ATP试剂3.缓冲液以Tris-Acetate作为缓冲液

5、。称取一定量的Tris碱，使定容后的浓度为0.05mol/l，定容前需要先调节PH值。将PH计插入TrisI溶液中，慢慢滴加乙酸溶液，直到PH值为7.8，然后定容，在4ºC下保存。4.ATP提取液采用三氯醋酸（TCA）作为ATP提取剂，浓度为0.03g/ml，在4ºC下保存。对于不同的微生物，采用不同的浓度进行提取，细菌和真核细胞的提取浓度一般为0.005-0.025g/ml，酵母真菌类则适当高一些。提取结束后，要用缓冲液将TCA的浓度稀释到一定的浓度，再进行测量，以减少TCA对反应的影响。四.实验材料与仪器TD-20/20荧光光度计抽滤器及真空泵（过滤微生物进，采用0.

6、22微米的滤膜）PH计。五.操作步骤1.ATP的提取在测量微生物的ATP前，需要将ATP从微生物内提取出来，ATP的提取效率直接影响生物量测定结果。因此，ATP的提取也就成为ATP生物发光法测定生物量和重要步骤之一。TCA法和加热煮沸法是两种常用的ATP提取方法。TCA法TCA法是目前最常用的ATP提取方法。TCA对活细胞有两种作用：一是破裂细胞，释放ATP，二是ATP水解酶失活。提取普通微生物中的ATP时，TCA浓度为0.015g/m此浓度下，TCA对ATP与荧光素酶的生物发光反应较强的抑制作用，必须在反应前对提取液进行中和，稀释。使TCA浓度小于或等于0.001g/m

7、l，此时TCA对反应的影响基本可以忽略。一般采用PH7.8左右的Tris-Aectate缓冲液进行稀释。具体操作取样品（如河水等，如果是固体样品需用水悬浮后取上清或匀浆）2ml置于试管中↓↓加入2mlTCA溶液，震荡提取得3min取1ml提取液置于50ml容量瓶中，用PH7.8的Tris-Aectate缓冲液定容稀释后的提取液置于4ºC下保存待测。↓此时TCA的浓度为0.0003g/ml，不会对反应产生影响加热煮沸法加热煮沸法是前期研究中采用较多的ATP提取方法。该方法先将样品中的微生物过滤出来，再将其置于缓冲液中加热煮沸提取