流动注射化学发光法测定溶菌酶含量.pdf

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1、第39卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究简报第7期2011年7月ChineseJournalofAnalyticalChemistry11O0～l103DOl：10．3724／SP．J．1096．2011．O1100流动注射化学发光法测定溶菌酶含量嵇正平王俊韩静胡效亚(扬州大学化学化工学院，食品化学研究所，扬州225002)摘要基于溶菌酶催化水解壳聚糖的产物氨基葡萄糖，与金溶胶一鲁米诺可产生很强的化学发光，建立流动注射化学发光测定溶菌酶含量的方法。对水解和化学发光反应条件进行了考察。结果表明，pH4．0、50

2、℃水解5h为最佳水解条件。在金胶、鲁米诺及NaOH的浓度分别为0．05，0．05和10mmol／L条件下，化学发光检测效果最好。在优化条件下，溶菌酶浓度在5～800g／L范围内与化学发光强度有良好的线性关系，方法的检出限为4g／L。本方法可用于蛋清中溶菌酶含量的检测。关键词化学发光；溶菌酶；壳聚糖；鲁米诺1引言溶菌酶又称胞壁质酶或乙酰胞壁质聚糖水解酶，广泛存在于植物、鸟类、哺乳动物、细菌等生物体内及分泌物中。作为一种动物体内在的抗体，它可以通过溶解细菌尤其是革兰氏阳性菌的细胞壁，阻止细菌的入侵。因此，溶菌酶常被用作

3、肉类、奶酪、蔬菜和新鲜水果等物品的防腐剂，也有一些文献报道了其作为抗感染和溃疡药物的应用]。溶菌酶的使用存在一些争议，因为有个案研究显示，溶菌酶会导致过敏]。所以，研究溶菌酶的检测方法很有意义。目前，检测溶菌酶的方法有免疫检测法】、分光光度法、HPLC法[5]、质谱法及荧光法等。化学发光法具有简单、快速、灵敏度高、线性范围宽等优点，其中应用最广泛的是鲁米诺体系~。。Zhang等报道的纳米金属材料催化鲁米诺化学发光体系，可用于含氨基化合物的检测[1。其化学发光机理为：纳米金属材料催化溶解氧氧化含氨基的螯合剂生成HO：

4、，进而氧化鲁米诺产生化学发光。此基础上，本研究利用溶菌酶催化水解壳聚糖，产生氨基葡萄糖，再被纳米金一鲁米诺化学发光体系所检测，建立了溶菌酶的化学发光检测新方法。2实验部分2．1仪器与试剂IFFM—E型流动注射化学发光仪(西安瑞迈分析仪器有限公司)；Tecnai一12(120KV)透射电镜(飞利浦公司)；PHs一25型数显pH计(上海精密科学仪器有限公司)。20mg／L溶菌酶储备液：将20mg溶菌酶(二次结晶，活力≥20000．0U／mg)溶于水，定容至1000mL，4℃冷藏备用；l％壳聚糖储备液：称取10．00g壳

5、聚糖(1．5×10kDa)溶于1000mL醋酸(1％)一醋酸钠(1％)缓冲液中；10mmol／L鲁米诺(陕西师范大学)储备液；1％柠檬酸钠溶液；0．2mmol／L氯金酸溶液；0．1mol／LNaOH；0．1mol／LHC1，以上试剂为分析纯，本实验用水均为二次蒸馏水。2．2金胶的制备采用文献[18]的方法，将100mL氯金酸溶液加热至沸，在剧烈搅拌下迅速加入3．00mL柠檬酸钠溶液，搅拌条件下回流15min，去掉热源继续搅拌10min，得粒径为19nm的纳米金胶。将制得的金胶冷却至室温，放于冰箱(4℃)中备用。通过

6、改变柠檬酸钠溶液的加入量，可以制得不同颗粒的金胶。2010-1卜25收稿；201卜03一l5接受本文系863计划专题项目(No．2009AA03Z331)资助E—mail：xyhu@yzu．educa第7期嵇正平等：流动注射化学发光法测溶定菌酶含量2．3壳聚糖的水解分别移取壳聚糖储备液2．00mL，再加入不同量溶菌酶溶液，用HC1或NaOH调至pH一4．0，稀释至50．00mL，50℃恒温水解5h得水解样。同时，制得不加溶菌酶的样品空白。2．4化学发光检测流动注射发光装置如图l所示，样品空白c与水解样s通过换向阀交

7、替进入管路，再与碱性鲁米诺溶液R(0．05mmol／L鲁米诺+20mmol／LNaOH)混合，混合液在化学发光池与金溶胶R2(0．05mmol／L)接触，化学发光讯号被光电倍增管PMT检测。记录发光强度与时间的关系曲线，根据峰值高度计算溶菌酶含量。各管路流量均为2．0mL／min，流通管内径2mm。样品罕臼，、Sampleblank水解样SampleJl光电倍增管f鲁米LinolR儿。IPhotomultiplierlumtubeI金溶胶dsR2Goldcolloi图1流动注射化学发光检测示意图Fig．1Schem

8、aticdiagramofCLflowsystem3结果与讨论3．1水解条件改变壳聚糖储备液的体积，并于不同的水解时间取样进行分析。结果表明，随着壳聚糖用量增加、水解时间的增长，被检出的化学发光增强。当壳聚糖体积大于2mL、水解时间达5h，发光强度变化较缓。过大的壳聚糖体积及过长的时间均导致基线的噪音过大。本研究中壳聚糖体积选择为2mL、水解时间为5h。考察