间接elisa法测定大肠杆菌dh5α菌体蛋白含量的实验研究

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1、间接ELISA法测定大肠杆菌DH5α菌体蛋白含量的实验研究免疫学杂志1999年第4期第15卷技术与方法作者:邓瑞春白云秀张明伟汪劲松黄英毛宁单位:军事医学科学院瑞得四环生物技术研究所北京100850关键词:酶联免疫吸附测定粒细胞巨噬细胞集落刺激因子大肠杆菌  摘要采用大肠杆菌DH5α菌体蛋白免疫家兔制备抗血清,建立了间接ELISA方法经初步测定,该方法的灵敏度0.5ng/ml,比聚丙烯酰胺凝胶电泳的考马斯亮蓝染色方法的灵敏度高3000倍,比银染色方法的灵敏度高150倍。在20~620ng/ml范围内测定呈直

2、线关系,直线相关系为0.895。经8次重复测定,显示很好的重复性。可用于测定rhGM-CSF等基因工程产品中DH5α菌体蛋白的残余量。  中图号R371-34  DETERMINATIONOFTHEE.COLIDH5αPROTEINREMAINSIN  GENICENGINEERINGSEMI-FINISHEDPRODUCTGM-CSFDengRuichun,BaiYunxiu,ZhangMingwei,WangJinsong,HuangYing,MaoNing  (ReadFour-RingInstitu

3、teofBiotechnology,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Beijing100850)  AbstractTheantiserumwerepreparedagainstthetotalDH5αproteinbyimmunizingrabbits,andthenamethodwasestablishedtodeterminetheremnantsE.coliDH5αproteininthegeneengineeringsemi-finishedpro-ductofr

4、hGM-CSF.Thesensitivityisabout0.5ng/ml,3000timeshigherthanthatofCoomasieBriliantBluestai-ningand150timesthanthatofsilverstainingofPAGE.Thelinearrangeofthemethodisbetween20-620ng/mlandthecorrelationcoefficient(r)is0.985,andrepeativityisgood.  KeywordsEnzyme-

5、likedimmunosorbentassay(ELISA),Recombinehumangranulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor(rhGM-CSF),Escherichiacoli(E.coli)  大肠杆菌DH5α是目原核细胞表达系统中,应用最普遍的基因工程菌之。人重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、人重组白细胞介素-2(rhIL-2)、人重组干扰素-α(rhIFN-α)等外源基因,都是在该宿主菌中获得高效转录和表达的。随着对基因工程产

6、品在临床上的大量应用,对产品中宿主蛋白残余量的要求越来越严格。目前常用来鉴定残余蛋白的方法有:聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),毛细管电泳(CE),等电聚焦(IEF),HPLC(包括凝胶过滤,各种反相HPLC,离子色谱,疏水色谱等)。此外,还有一些化学法如观察末端是否均一等等。本文建立了间接ELISA方法,它简便、快速、灵敏、经济,是一种非常值得推广的方法。  1材料和方法  1.1材料  大肠杆菌DH5α菌体蛋白,由本室培养制备;HRP-羊抗兔IgG,购自本院微生物流行病学研究所;Western印迹

7、试剂盒,购自Sigma公司;卡介苗,购自北京生物制品所。BDSLImmunoskan340型酶联仪,英国;电泳仪,购自北京六一仪器厂。  1.2方法  1.2.1大肠杆菌DH5α培养及菌体蛋白的测定[3,4]:于LB培养基中培养大肠杆菌DH5α,经离心收集菌体,生理盐水洗2次,超声破碎,离心15000r/min10min,收集上清菌体蛋白,紫外分光光度法测定蛋白光吸收值,通过公式:mg/ml蛋白=1.45×OD280-0.74×OD260计算含量,SDS-PAGE对DH5α菌体蛋白成分进行分析。  1.2.

8、2大肠杆菌DH5α菌体蛋白免疫:于免疫前1周,兔两侧腹股沟淋巴结注射卡介苗0.7mg,取4mg大肠杆菌DH5α菌体蛋白与1ml福氏完全佐剂混合,制成乳剂,于背部皮下多点免疫;2周后,注射不完全佐剂,免疫原剂量同前。随后,每隔2周加强1次,连续注射3次,最后1次自腹腔注射9mg抗原蛋白。7d后放血,收集血清,分装,于-20°C保存。  1.2.3抗体效价测定:按文献[1]琼脂糖免疫双相扩散法。制备1%琼脂糖胶,铺板

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