间接elisa法测定抗人血清白蛋白效价

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1、间接ELISA法测定抗人血清白蛋白效价作者：ZP（成都医学院检验医学院09级医学检验本科二班，610500）【摘要】 目的通过运用间接ELISA法，来测定抗人血清白蛋白的效价。方法用抗原、酪蛋白分别包被、封闭微孔板，再加入待检血清、一抗、二抗，建立间接包被模式酶联免疫法。经方阵滴定确定抗原和酶标抗体的最适浓度后，测定抗体效价。结果在包被的人ALB浓度为0.1ug/ml，二抗1：20000的稀释倍数时，测出的抗人ALB的效价范围为1：51200。结论运用间接ELISA法，在检测抗人ALB的灵敏度高，优化了反应条件，可用于初步抗人ALB的检测。【关键词】 间接ELISA

2、；抗人血清白蛋白；效价；羊抗人ALB、兔抗羊IgG-HRP间接ELISA法，是目前最常用的方法，因其灵敏度高，操作简便而被运用广泛。此方法是测定抗体最常用的方法，属于非竞争结合试验。其原理是将抗原连接到固相载体上，样品中待测抗体与之结合成固相抗原-受检抗体复合物，再用酶标二抗与固相免疫复合物中的抗体结合，形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物，测定加底物后的显色程度，确定待测抗体含量。此次试验就是用间接ELISA测定未知的抗人ALB的效价。1、主要试剂、仪器、材料及主要溶液的配制1.1主要试剂：人ALB标准品（250mg/支）；一抗(羊抗人ALB，效价1:701ml

3、/瓶，批号：201106贮存于4～20℃，有效期：2年)；二抗(兔抗羊IgG-HRP，购自武汉博士德生物工程有限公司)；显色剂：A液、B液，ME002可溶性TMB显色液；终止液（2MH2SO4）；包被液：0.05MPH9.6碳酸盐缓冲液；洗涤液0.05%TWEEN-PBS；PBS缓冲液0.1MPH7.4；封闭液1%酪蛋白-PBST.1.2仪器：洗板机（BIO-RADMODEL1575）、孵箱（上海-恒科学仪器有限公司型号：DHP-9272）、SM-3自动化酶免疫分析仪（北京天石医疗用品制作所）1.3材料：96孔酶标板、一次性塑料试管、加样枪（上海求精生化试剂仪器有限

4、公司）1.4主要溶液的配制：1)、0.05Mol/LPH9．6的碳酸盐缓冲液（包被稀释液）：准确称取1.6g碳酸钠，2.9g碳酸氢钠于烧杯中加水适量使溶解，用去离子水定溶于1L的容量瓶中，同时调节PH值至9.6；2)、PH7.4PBS缓冲液:准确称取氯化钠8g，氯化钾0.2g，十二水和磷酸氢二钠3.58g，磷酸二氢钾0.2g于烧杯中，用去离子水定溶于1L的容量瓶中，同时调节PH值至7.4；3)、封闭液1%酪蛋白-PBS-T：准确称取3g酪蛋白于以洁净烧杯中，再加入300mlPBS溶液和150ulTween20。将烧杯置于电炉上边搅拌边加热，直至酪蛋白完全溶解；4)、

5、洗涤液0.05%TWEEN-PBS：向1000mlPH7.4PBS缓冲液中加入500μlTween20。PBS-T既是洗板液也是溶解封闭剂酪蛋白（1%）的溶解试剂，配方为PBS+Tween20.2、方法2.1微孔板制备：将96孔板划分为四个区域，每个区域4行6列。在1至4区的每微孔中分别加入100ul浓度为10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml的包被抗原，用标签纸封板后，于4℃-5-下过夜。取出微孔板于洗板机中洗涤3次，拍干后，每孔加入300ul1%酪蛋白-PBS-T封闭液,，用标签纸封板后，4℃过夜。2.2标本及酶标二抗的加入：从冰箱中

6、取出微孔板并于洗板机中洗涤3次，拍干后，向每一区域前5列微孔板中分别加入100μl浓度为1:100,1:400,1:1600，1:6400,1:12800的标本-羊抗人ALB，最后一列加入100μlPBS/孔，封板后于37摄氏度烘箱中孵育。1小时后取出微孔板，洗涤5次，拍干后向每一区域一至四行微孔板中分别加入100μl浓度1:1000,1:4000,1:16000，1:64000酶标抗体兔抗羊-HRP，37℃孵育30分钟。滴加一抗、二抗的布局如表1所示。羊抗人Alb血清羊抗人Alb血清兔抗羊-HRP1:1001:4001:16001:64001:12800PBS兔抗

7、羊-HRP1:1001:4001:16001:64001:12800PBS1:1000人ALB: 10μg/ml1:1000人ALB: 1μg/ml1:4001:4001:16001:16001:640001:64000羊抗人Alb血清羊抗人Alb血清兔抗羊-HRP1:1001:4001:16001:64001:12800PBS兔抗羊-HRP1:1001:4001:16001:64001:12800PBS1:1000人ALB: 0.1μg/ml1:1000人ALB: 0.01μg/ml1:4001:4001:16001:16001:640001:64000表12