酶联免疫吸附试验(ELISA)ELISA夹心法测定抗原ELISA间接法测定

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1、酶联免疫吸附试验（ELISA）ELISA夹心法测定抗原ELISA间接法测定抗体原理及意义酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用结合起来的一种敏感性很高的新型免疫检测技术。将已知抗原或抗体吸附在固相载体微孔聚苯乙烯塑料板上，通过抗原抗体特异性结合吸附待测样品中的抗体或抗原后，加酶标抗体（酶与抗体或抗原结合后，既不改变抗体或抗原免疫反应的特异性，又不影响酶本身的活性）和底物后，在相应酶底物的作用下生成有色物质，其颜色深浅

2、与标记物中相应的抗体或抗原的含量呈正比，由此可测定抗原或抗体的含量。常用的ELISA法有双抗体夹心法测定抗原和间接法测定抗体。ELISA法双抗体夹心法测定抗原1.原理一步法二步法常用试剂盒分一步法和二步法，二者原理完全相同。一步法将图中的第2步和第3步同时进行，允许混合加入，其形成的免疫复合物，基本不影响目测的结果，适用于目测结果。二步法如图中第2步和第3步由于分步进行，其结果较准确，主要用于需要定量检测时。2.材料（以测HBsAg为例）试剂：HBsAg诊断试剂盒器材：酶联仪，微量加样器，吸头等3.方法加样：每组7微孔，待检4孔，空白对照1

3、孔，阴、阳性对照各1孔。分别加阴、阳性对照1滴和50ul待测样本于相应孔内，置37℃水浴箱温育30分钟。加酶：除空白对照孔外，每孔加1滴酶标溶液，混匀后封板，置37℃水浴箱温育30分钟。洗涤：用洗涤液（按说明配制）注满各孔，静置20秒，甩去洗涤液，重复4次，最后一次在吸水纸上拍干。显色：每孔加底物液A、B各1滴（50ul），轻拍混匀，置37℃水浴15分钟，肉眼观察。终止：每孔加终止液1滴（50ul），轻拍混匀。4.结果测定用酶标仪（450nm）测定各孔吸光度OD值（先用空白孔校零），P/N值≥2.1者判为HBsAg阳性，﹤2.1者判为阴性。

4、ELISA法间接法测定抗体1.原理2.材料（以测结核抗体为例）试剂：结核抗体诊断试剂盒器材：酶联仪，微量加样器，吸头等3.方法包被抗原：在聚苯乙烯微量反应板孔中加抗原100μl，4℃12－18小时。用1％BSA或正常兔血清4℃、12－18小时阻断，4℃冰箱备用。洗涤：用前应进行漂洗去除杂蛋白，用洗涤液洗3次，每次3分钟。加待测样本：将血清稀释成1：50，每份标本加复孔，每孔100μl，37℃保温30分钟。设已知的阳性和阴性血清对照。洗涤3次后，加兔抗IgG酶结合物，37℃保温30分钟，以相同的方法洗涤3次。加新鲜配制的邻苯二胺底物溶液和双氧

5、水溶液各100μl。静止20分钟，再加入3mol/L硫酸每孔50μl终止反应。4.结果测定肉眼观察：白色背景上观察四孔呈现的颜色反应，与已知阳性和阴性孔比较。酶联仪比色：酶联仪用492nm测OD值。正常人血清OD﹤0.39，结核患者≥0.4。正常人存在着结核抗体，一般为0.2－0.39。儿童卡介苗接种和隐性结核菌感染时可﹥0.4，但患结核病结核抗体OD值≥0.6，为轻度升高。