ELISA-双抗夹心法检测抗原.ppt

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1、ELISA双抗体夹心法检测抗原王春复旦大学免疫学系复旦大学免疫生物学研究所<<细胞与分子免疫学技术>>酶联免疫吸附实验(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay，ELISA)一种固相酶免疫测定技术，利用酶标记的抗原或者抗体，在固相载体上定量或定性测定特异性抗体、可溶性抗原及细胞表面抗原。1971年由瑞典学者Engrall和Perlmann,荷兰学者weeman和Schuurs报道；开创了运用酶标记免疫技术进行液体标本中微量物质测定的实验方法；ELISA-测抗原（Ag）或抗体（Ab）三

2、要素抗原或抗体的固相化：已知的Ag/Ab结合到固相载体表面，并保持其免疫活性；抗原或抗体的酶标记：酶标Ag/Ab,并保持其免疫活性和酶活性；底物显色：底物被酶催化成为有色产物—定性和定量–放大免疫反应的信号基本原理高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值基本特点基本类型抗体测定法间接法检测特异性抗体抗原测定法直接竞争法检测可溶性抗原双抗体夹心法检测可溶性抗原（改良双抗体夹心法检测可溶性抗原）应用生物素-亲和素双抗体夹心EL

3、ISA法基本类型抗体测定法间接法检测特异性抗体抗原测定法直接竞争法检测可溶性抗原双抗体夹心法检测可溶性抗原（改良双抗体夹心法检测可溶性抗原）应用生物素-亲和素双抗体夹心ELISA法显色间接法检测特异性抗体包被已知抗原与待测抗体孵育与酶标抗体孵育加入底物包被已知抗原优点:只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法操作简单迅捷缺点：可重复性差通常用于抗体效价的检测和某些疾病的早期诊断基本类型抗体测定法间接法检测特异性抗体抗原测定法直接竞争法检测可溶性抗原双抗体夹心法检测可溶性抗原（改良双抗体

4、夹心法检测可溶性抗原）应用生物素-亲和素双抗体夹心ELISA法直接竞争法检测可溶性抗原原理：待检抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合；待检抗原含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。优点：待检抗原只需要一个抗原决定簇，适合小分子抗原，如，激素，药物等；操作步骤简单快捷，只需要一个保温洗涤过程缺点：酶标记抗体用量大；定量检测的灵敏度和重复性存在不足。基本类型抗体测定法间接法检测特异性抗体抗原测定法直接竞争法检测可溶性抗原双抗体夹心法检测可溶性抗原（改良双抗体夹心法检测可溶性抗原）应用生物

5、素-亲和素双抗体夹心ELISA法改良双抗夹心法双抗体夹心法检测可溶性抗原双抗夹心法优点：待测抗原需要≥2个抗原决定簇，所以适合大分子抗原的检测，一般在分子量5000D以上；由于增加了一层抗体，提高了特异性检测的灵敏度，尤其是改良双抗夹心法；只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物就可以建立此法；重复性较好；缺点：操作复杂，费时费力基本类型抗体测定法间接法检测特异性抗体抗原测定法直接竞争法检测可溶性抗原双抗体夹心法检测可溶性抗原（改良双抗体夹心法检测可溶性抗原）应用生物素-亲和素

6、双抗体夹心ELISA法应用生物素-亲和素双抗体夹心ELISA法（BA-ELISA法）间接包被放大终末反应BA-ELISA原理BA-ELISA是在常规ELISA原理的基础上，结合生物素(B，biotin)与亲和素(A，avidin)间的高度放大作用，而建立的一种检测系统。生物素是动植物体内广泛分布的一种小分子生长因子，又名辅酶R或维生素H；亲和素是卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，对生物素有非常高的亲和力；（链酶亲和素是从链霉菌中提取，对载体吸附性比前者低）亲和素与生物素都可与蛋白质(包括抗原、抗体、酶等)

7、、荧光素等分子结合而不影响后者的生物活性，是理想的标记剂；结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，达到检测未知抗原(或抗体)分子的目的。实验材料小鼠INF-γ检测试剂盒的组成：CaptureAb：purifiedanti-mouseIFN-γDetectionAb：biotin-conjugate-anti-mouseIFN-γAvidin-conjugate-HRPStandard：recombinantmouseIFN

8、-γ（定量测定）Coatingbuffer5×AssaydiluentTMBsolution待测样品----经ConA活化的小鼠淋巴细胞培养上清ELISA操作要点样品的保存试剂的准备固相载体包被加样孵育(温育）洗涤显色和比色样本的制备与保存：血清样品和细胞培养上清：5天内测定，可以放置于4℃，超过一周，-80℃保存；ConA活化的小鼠淋巴细胞培养上清：分别于活化后不同时间点收集培养的细胞，2000rpm，4℃离心分离上清，冰上