酶联免疫吸附试验ELISA

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1、实验五1.酶联免疫吸附试验（ELISA)2.补体结合反应1.酶联免疫吸附试验（ELISA)免疫标记技术定义：将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。分类：放射免疫测定法：131I，32P免疫荧光技术：FITC，PE免疫酶测定法：HRP，AP免疫酶测定法(EnzymeImmunoAssay,EIA)用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP)特点：高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性高灵敏度：酶催化底物显色的高效

2、性，pg水平微量检测定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值分类：酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体酶免疫组化法：组织中或细胞表面的抗原。酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗体或抗原的方法。1.定义2.分类间接法（IndirectELISA）：将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗检测液相中未知抗体双抗体夹心法（SandwichELISA)：将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗检测液相中的可溶性抗原竞争法（CompetitiveEL

3、ISA)：将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体检测液相中的可溶性抗原或抗体酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)3.原理（以间接性ELISA为例）：显色实验内容：间接法测定溶血素——定性检测实验材料脱纤维绵羊红细胞——抗原兔抗绵羊红细胞抗体（溶血素）——待测兔血清HRP标记羊抗兔IgG——二抗包被缓冲液：0.05MpH9.6碳酸盐缓冲液洗涤液：含0.05%Tween20的0.01MpH7.4PBS底物缓冲液：pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液底物溶液：OPD10mg，底物缓

4、冲液25ml，30%H2O240μL酶标板，酶标仪实验方法1.抗原的处理：脱纤维绵羊血加3mLN.S，混匀2000rpm，5min加3mLN.S，混匀2000rpm，5min取2mL压积红细胞加入2mL蒸馏水，震荡破碎红细胞用包被缓冲液稀释成1：400备用2.包被抗原：取酶标板，加入100μL/孔的抗原稀释液4℃，湿盒内，18h取出包被好抗原的酶标板（4孔/组），甩干孔内液体以洗涤液（200μL/孔）洗涤3次，3min/次3.加待测血清标记各孔，加入相应液体100μL/孔1234阴性空白阳性待测4.加二抗：37℃，湿盒内，30min甩

5、干孔内液体以洗涤液（200μL/孔）洗涤3次，3min/次各孔加入酶标二抗100μL/孔37℃，湿盒内，30min5.显色：甩干孔内液体以洗涤液（200μL/孔）洗涤3次，3min/次加入底物溶液100μL/孔避光显色，10min6.观察结果实验方法预期结果阳性：显色为黄色阴性：无色1234阴性阴性阳性阳性注意事项洗涤彻底，避免交叉污染。按顺序加样，孔底无气泡。包被和温育在湿盒内进行。2.补体结合反应（ComplementfixationTest,CFT）概念：补体结合反应：是指在补体的参与下，以绵羊红细胞（SRBC）和溶血素（抗SR

6、BC的抗体）作为指示系统的抗原抗体反应。补反中包括两个系统五种成分：待检系统：已知Ag或Ab、待检Ab或Ag及仅供一组Ag-Ab系统反应的定量补体。指示系统：绵羊红细胞和溶血素。原理：待测系统抗原+未知血清12补体12Step1抗原抗体复合物的形成Step2补体的结合和耗竭指示系统SRBC+抗SRBC抗体Step3SRBC的裂解121：NoAb；2：AbAg待测血清Ab阳性NoAb阴性AgAgAg抗原：伤寒菌裂解产物待测血清：56℃，30min补体：豚鼠血清2%绵羊红细胞溶血素材料：方法：12345试验管血清对照管抗原对照管补体对照管

7、SRBC对照管待测血清0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.4mL0.8mL抗原补体N.S摇匀，37℃，水浴15min溶血素SRBC0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL0.2mL………………………………………………摇匀，37℃，水浴15min（1份/2人）预期结果：1．管内液体混浊呈浅红色为不溶血，管内液体透明呈红色为溶血。溶血不溶血2.试验管血清对照管抗原对照管补体对照管SRBC对照管？溶血溶血溶血不溶血绵羊红细胞用前应轻晃

8、混匀，不可剧烈震荡。各种试剂的吸管不可混用。注意事项：