实验四-酶联免疫吸附试验-ELISA课件.ppt

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1、实验四阻断酶联免疫吸附试验（阻断ELISA)免疫标记技术定义：将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。分类：放射免疫测定法：131I，32P免疫荧光技术：FITC，PE免疫酶测定法：HRP，AP免疫酶测定法(EnzymeImmunoAssay,EIA)用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP)特点：高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值分

2、类：酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体酶免疫组化法：组织中或细胞表面的抗原。酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗体或抗原的方法。1.定义2.原理（1）利用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接。（2）通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。3.常用种类直接法（directELISA）：将已知抗原直接吸附于载体，加酶标抗体检测抗体间接法（IndirectELISA）：将已知抗原吸附于固相载体，加酶标记二抗检测液相中

3、未知抗体双抗体夹心法（SandwichELISA)：将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗检测液相中的可溶性抗原竞争法（CompetitiveELISA)：将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体检测液相中的可溶性抗原或抗体阻断法（BlockELISA)：将已知抗原吸附于固相载体，酶标记单克隆抗体检测液相中的可溶性抗体（1） 直接法测定抗原A.     将抗原吸附在载体表面；B.     加酶标抗体，形成抗原—抗体复合物；C.加底物。底物的降解量＝抗原量。（2）间接法测定抗体A.     将抗原吸附于固相载体表面；B.     加抗体,形成抗原

4、-抗体复合物;C.     加酶标抗体；D.加底物。测定底物的降解量＝抗体量。（3）双抗体夹心法测定抗原A.     将抗体吸附于固相表面;B.     加待检抗原，形成抗原-抗体复合物;C.    加酶标抗体;E.加底物。底物的降解量＝抗原量。（4）竞争法测定抗原A.    将抗体吸附在固相载体表面;B.同时加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体；对照只加入酶标抗原；C.加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差＝未知抗原量。（5）阻断法测定抗体本法主要用于检测型特异性抗体。该方法现已成为猪传染性胃肠炎（TGE）、猪伪狂犬病（PR）及猪胸膜肺炎（AP）的主

5、要检测方法。A. 将抗原吸附在固相载体表面;B.先加待检血清（抗体）,形成抗原-抗体复合物;C.  再加酶标单抗；D.加底物。酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)4.原理（以ELISA为例）：显色酶标单抗酶标单抗实验材料猪伪狂犬病毒（PRV）——抗原阴性对照阳性对照样品——待测猪血清HRP标记猪PRV单抗——酶标单抗包被缓冲液：0.025MpH9.6碳酸盐缓冲液洗涤液：含0.05%Tween20的0.01MpH7.4PBS底物缓冲液：pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液底物溶液：TMB（四甲基联苯胺）

6、，底物缓冲液，30%H2O2，新鲜配制酶标板，酶标仪阻断法测定猪伪狂犬病病毒ELISA抗体——定性检测实验方法1.抗原的处理：2.包被抗原：取酶标板，加入100μL/孔的抗原稀释液4℃，湿盒内，18h取出包被好抗原的酶标板（4孔/组），甩干孔内液体以洗涤液（200μL/孔）洗涤3次，3min/次3.加待测血清标记各孔，加入相应液体100μL/孔1234阴性空白阳性待测4.加单抗：37℃，湿盒内，30min甩干孔内液体以洗涤液（200μL/孔）洗涤3次，3min/次各孔加入酶标单抗100μL/孔37℃，湿盒内，30min5.显色：甩干孔内液体以洗涤液（

7、200μL/孔）洗涤3次，3min/次加入底物溶液100μL/孔避光显色，10min6.观察结果实验方法1、取已包被猪伪狂犬病毒抗原的酶标板（根据样品多少，可拆开分次使用），用样品稀释液（PBS）将待检血清1∶1稀释后加入板孔中，每孔加100μl。同样1∶1稀释阴、阳性对照血清，阴、阳性对照各设1孔，每孔100μl。另设一空白对照孔，空白对照孔加100μl稀释液。轻轻振匀孔中样品（勿溢出），置37℃温育30分钟。2、洗板：甩掉板孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液200μl，静置3分钟倒掉，再在吸水纸上拍干，重复3次。3、每孔加酶标单抗100μl，置3

8、7℃温育30分钟。4、洗板：洗涤3次（方法同步骤2）。切记每次在干吸水纸上拍干。5、显色与终止：每孔先加底物