酶联免疫吸附实验 ELISA课件.ppt

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1、酶联免疫吸附实验EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay，ELISA第三军医大学免疫研究所杨承英752234-801实验目的掌握酶联免疫吸附实验的基本原理了解ELISA的不同类型熟悉双抗体夹心法检测乙肝表面抗原HBsAg的基本步骤实验原理抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。ELISA的类型ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunoso

2、rbent）；（2）酶标记的抗原或抗体，称为"结合物"（conjugate）；（3）酶反应的底物。可设计出各种不同类型的检测方法。ELISA分类双抗体夹心法双位点一步法间接法测抗体竞争法捕获法测IgM抗体应用亲和素和生物素的ELISA将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体加受检标本加酶标抗体加底物最常用于检测抗原①②双抗体夹心法（主要用于测定抗原）双位点一步法（直接法）针对抗原两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体。简化了操作，缩短了反应时间间接法（主要用于测定抗体）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原加稀释的受检血清加酶标抗抗体

3、加底物显色主要用于测定抗体含量竞争法（既可测抗原也可测抗体）将特异抗原与固相载体连接，形成固相抗原待测管中加受检标本和一定量酶标抗体的混合溶液，使之与固相抗原反应加底物显色结合于固相的酶标抗体量与受检抗体的量呈反比。可用于测定抗原，也可用于测定抗体捕获法(测IgM抗体)将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM加入稀释的血清标本加入特异性抗原试剂加入针对特异性抗原的酶标抗体加底物显色测定血清中的IgM含量应用亲和素和生物素的ELISA亲和素：糖蛋白，由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。现在使用较多的是链霉和素（strepavidin）

4、。生物素（biotin）又称维生素H，可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗原固相化。酶标抗体用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素－生物素－酶结合物，以放大反应信号。显色原理（底物与酶标抗体的反应）HRP（辣根过氧化物酶）+TMB即四甲基联苯胺（Tetrabenzidine）蓝绿色实验材料乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒酶标记抗体阳性对照阴

5、性对照显色剂A（TMB显色系统）显色剂B终止液样本BIO-RADModel3500自动酶联检测仪（重庆埃夫朗生物技术有限责任公司）实验步骤包被抗体（已准备好）第1孔加入100ul阳性对照，2－5孔每孔加入80ulPBS，从第1孔吸取20ul到第2孔，用加样器反复吸排混匀，同样从第2孔吸取20ul到第3孔，最后一空吸弃20ul，第6孔加入80ul阴性对照，其余六孔操作同前六孔。室温孵育30min每孔加入一滴酶标记抗体，室温孵育30min弃尽每孔液体，用洗涤液洗6次每孔加显色剂A、B各一滴，37℃避光孵育15min加入终止液终止反应注意事项加样：必需保证每个

6、孔之间的样本量相同。孵育：1)孵育时贴封片或加盖;2)孵育时间严格掌握。洗板：洗板要彻底，每个孔之间的枪头必须每次要替换。显色：如果样本较多的话，速度要快，以保持各个样本孔之间的均一性。终止：应避免产生气泡。读板：应保证酶标板清洁。结果分析肉眼观察：显色为阳性，无色为阴性。酶免分析仪检测：450nm波长，空白孔调零，测各孔吸光光度值OD450。结果判定：以待测样本OD值/阴性对照OD值>2.1为阳性，反之阴性。如果阳性孔为阴性，考虑是否是酶标抗体或者显色剂等失效实验报告实验名称实验目的实验原理实验步骤结果分析周一科代表收齐交至801