酶联免疫吸附试验-ELISA.ppt

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1、实验四酶联免疫吸附试验（ELISA)免疫标记技术定义：将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。分类：放射免疫测定法：131I，32P免疫荧光技术：FITC，PE免疫酶测定法：HRP，AP免疫酶测定法(EnzymeImmunoAssay,EIA)用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP)特点：高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值分类：酶联免疫吸附试验：可

2、溶性抗原或抗体酶免疫组化法：组织中或细胞表面的抗原。酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗体或抗原的方法。1.定义2.原理（1）利用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接（或建立关联）。（2）通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。它将酶促反应的高效率和免疫反应的高度专一性有机地结合起来，可对生物体内各种微量有机物的含量进行测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。3.分类直接法（directELISA）：将已知抗原直接吸附于载体，加酶标抗体检测抗体间接法（In

3、directELISA）：将已知抗原吸附于固相载体，加酶标记二抗检测液相中未知抗体双抗体夹心法（SandwichELISA)：将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗检测液相中的可溶性抗原竞争法（CompetitiveELISA)：将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体检测液相中的可溶性抗原或抗体（1） 直接法测定抗原A.将抗原吸附在载体表面；B.加酶标抗体，形成抗原—抗体复合物；C.加底物。底物的降解量＝抗原量。（2）间接法测定抗体A.将抗原吸附于固相载体表面；B.加抗体,形成抗原-抗体复合物;C.加酶标抗体；D.加底物。测定底物的降解量＝抗体量。（3）

4、双抗体夹心法测定抗原A.将抗体吸附于固相表面;B.加待检抗原，形成抗原-抗体复合物;C.加酶标抗体;E.加底物。底物的降解量＝抗原量。（4）竞争法测定抗原A.将抗体吸附在固相载体表面;B.加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体；对照只加入酶标抗原；C.加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差＝未知抗原量。酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)4.原理（以间接ELISA为例）：显色间接法测定猪瘟抗体——定性检测实验材料猪瘟病毒（CSFV）——抗原样品——待测猪血清HRP标记猪抗兔IgG——二抗包被缓冲液：0.025

5、MpH9.6碳酸盐缓冲液洗涤液：含0.05%Tween20的0.01MpH7.4PBS底物缓冲液：pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液底物溶液：TMB，底物缓冲液，30%H2O2酶标板，酶标仪间接法测定猪瘟抗体——定性检测实验方法1.抗原的处理：2.包被抗原：取酶标板，加入100μL/孔的抗原稀释液4℃，湿盒内，18h取出包被好抗原的酶标板（4孔/组），甩干孔内液体以洗涤液（200μL/孔）洗涤3次，3min/次3.加待测血清标记各孔，加入相应液体100μL/孔1234阴性空白阳性待测4.加二抗：37℃，湿盒内，30min甩干孔内液体以洗涤液（200μL/孔）洗涤3次，

6、3min/次各孔加入酶标二抗100μL/孔37℃，湿盒内，30min5.显色：甩干孔内液体以洗涤液（200μL/孔）洗涤3次，3min/次加入底物溶液100μL/孔避光显色，10min6.观察结果实验方法1、取已包被猪瘟病毒抗原的酶标板（根据样品多少，可拆开分次使用），用样品稀释液（PBS）将待检样品1∶40稀释后加入板孔中，每孔加100μl。同样1∶40稀释阴、阳性对照血清，阴、阳性对照各设1孔，每孔100μl。另设一空白对照孔，空白对照孔加100μl稀释液。轻轻振匀孔中样品（勿溢出），置37℃温育30分钟。2、洗板：甩掉板孔中的溶液，用洗涤液洗板3次，200

7、μl/孔，每次在干净吸水纸上拍干。3、每孔加酶标二抗（抗猪IgG-HRP结合物）100μl，置37℃温育30分钟。4、洗板：洗涤3次（方法同步骤2）。5、显色与终止：每孔加底物A液、B液各1滴(50μl)，混匀。室温避光显色，10分钟后，每孔加终止液（0.25%氢氟酸）1滴(50μl)，终止反应。6、15分钟内测定结果。采用波长630nm的酶标仪测定OD值。检测样本的OD值≥0.35为阳性。具体操作步骤预期结果阳性：显色为黄色（蓝色）阴性：无色1234阴性阴性阳性阳性注意事项洗涤彻底，避免交叉污染。按顺序加样，孔底无气泡。包被和温育在湿盒内进行。