酶联免疫吸附试验.ppt

《酶联免疫吸附试验.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、酶联免疫吸附试验（Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)ELISA的基本原理①使抗原或抗体结合固相载体表面，并保持活性。②使抗体或抗原与某种酶连接成酶标抗体或抗原。③在测定时，把受检抗体（或抗原）和酶标抗原（或抗体）按不同的步骤与固相载体表面的抗原（或抗体）起反应。④用洗涤的方法去除未结合的酶标抗原（或抗体），最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。⑤加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物。⑥产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅来定性或定量分析。ELISA的类型ELISA可用于测定抗原，也可用

2、于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗原或抗体，（2）酶标记的抗原或抗体，（3）酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。一、双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：1.将抗体包被在固相载体上。2.如样品中含有抗原，则结合为抗原抗体复合物。3.再加入酶标记抗体，则结合为抗体-抗原-酶标记抗体复合物。4.酶催化底物并显色。+++固相抗体标本酶标抗体底物显色二、间接法测抗体间接法是检测抗体最常用的方法。操作步骤如下：1.将抗原包被在固相载体上。2.如样品中含有抗体，则结合为抗原抗体复合物。3

3、.再加入酶标记抗抗体，则结合为抗原-抗体-酶标记抗抗体复合物。4.酶催化底物并显色。+++固相抗原标本酶标抗体底物显色三、酶标抗原竞争法竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。1.将抗体包被在固相载体上。2.如样品中含有抗原，则优先竞争结合抗体，结合为抗原抗体复合物。3.同时加入酶标记抗原，抗原没有结合的位点酶标记抗原去占据，则结合为酶标记抗原-抗体复合物。4.酶催化底物并显色。YYY+YYY+YYY参考管酶标抗原YYY+YYY+YYY待测管酶标抗原抗原间接ELISA方法的建立1

4、、抗原最佳包被液的选择；2、抗原、血清和酶标二抗工作浓度的确定；3、封闭液的选择；4、封闭时间的优化；5、血清稀释液的选择；6、抗原抗体反应时间的优化。ELISA操作步骤以间接ELISA为例：1、包被抗原:用包被液将抗原稀释至合适浓度，加入到酶标板中，每孔100µl，4℃过夜；2、洗涤:弃去孔内液体，用洗涤液洗3次，每次3min，最后用吸水纸拍干；3、封闭：各孔加入封闭液200ul，37℃作用1h；4、洗涤；5、加被检血清：将血清样品稀释至最佳浓度，每孔100µL，每个样本两孔，每块板同时设阴性、阳性及空白对照各两孔，37℃作用30min；6、洗涤；7、酶标二抗：稀释HRP标记羊

5、抗猪IgG，每孔100µL，37℃作用30min；8、洗涤；9、显色：加新鲜配制的TMB底物液每孔100µL，室温避光作用15min；10、加终止液：加50µL 2mol/L硫酸；11、读数：用酶标仪检测OD450值。血清学方法有很多种,如传统的琼脂扩散(AGID)、血凝抑制(HA/HI)、乳胶凝集、试管凝集、补体结合等方法，但这些方法不是最合适的检测方法。EILSA技术与其有着不同的特点：1、灵敏度高。ELISA是通过酶促反应放大检测信号,从而提高检测的灵敏度,其检测限可达ng甚至pg水平,可做定量测定。2、特异性强。ELISA的每一步体的特异性识别过程,结构类似物、有色物质、

6、荧光物质等对检测的影响很小。3、样品的预处理过程和ELISA的操作步骤简单快捷，有的试剂盒仅需1~2个小时即可得出检测结果，并且可同时检测数十甚至上百个样品。4、设备简单，适用于基层。ELISA的优点：ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体，

7、而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。因此ELISA法在生物医学各领域的应用范围日益扩大。ELISA的应用