酶联免疫吸附试验

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1、实验三酶联免疫吸附试验（ELISA）一、实验目的了解ELISA的基本原理，掌握间接ELISA方法的原理与操作步骤。二、实验原理将抗原或抗体固化于某种载体的表面，并保持其免疫活性，加入待检血清（抗体），然后加入与其相对应的既有酶活性又有免疫活性的酶标抗体或抗原，它们之间反应后，通过洗涤去掉未结合的标记物。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，酶的降解底物和呈现的色泽在一定条件下是呈正比的，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析，因此可用分光光度计进行测定，计算出参加反应的抗原或抗体的含量，从而达到测定抗原或抗体的目的。常用酶及底物常用酶底物加终止液前颜色加终止液后颜色辣根过氧化物酶（H

2、RP）RZ>3.1碱性磷酸酶（AP）邻苯二胺（OPD）四甲基联苯胺（TMB）对硝基苯磷酸酯（p-NPP）橙黄色蓝色黄色棕黄色黄色黄色根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。常用的三种类型：　1、间接法测抗体（间接ELISA）4间接法用于测定抗体。它的原理是将已知抗原连接在固相载体上，待测抗体与抗原结合后再与酶标二抗结合，形成抗原-待测抗体-酶标二抗的复合物，复合物的形成量与待测抗体量成正比，属非竞争性反应类型。2、双抗体夹心法（双抗夹心ELISA）双抗体夹心法用于检测抗原。它是利用待测抗原上的两个抗原决定簇A和B分别与固相载体上的抗体A和酶标记抗体B结合，

3、形成抗体A-待测抗原-酶标抗体B复合物，复合物的形成量与待测抗原含量成正比，属非竞争性反应类型。操作：将抗体吸附于固相表面；加抗原，形成抗原-抗体复合物；加酶标抗体；加底物。底物的降解量＝抗原量。3、竞争ELISA竞争法既可用于检测抗原又可用于检测抗体。它是用酶标抗原（抗体）与待测的非标记抗原（抗体）竞争性的与固相载体上的限量抗体（抗原）结合，待测抗原（抗体）多，则形成非标记复合物多，酶标抗原与抗体结合就少，也就是酶标记复合物少，因此，显色程度与待测物含量成反比。三、主要仪器及试材以伪狂犬全病毒（PRV）间接酶联免疫吸附试验（PRV－ELISA）为例。使用猪伪狂犬抗体检测试剂盒。本试剂盒含:1

4、、包被抗原的微孔板；2、阴、阳性对照血清；3、抗猪IgG-HRP结合物；4、洗涤液；5、底物A液、B液；6、终止液；7、样品稀释液本实验所需仪器和试剂：1、酶联免疫测定仪2、已包被抗原（Ag）的酶标板（PRV蛋白）3、血清：PRV阳性血清、PRV阴性血清、待检样品血清4、酶标抗体（E-Ab）：兔抗猪IgG-HRP5、包被液（0.025mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液）：1.59gNaCO3，2.93gNaHCO3，加ddH2O至1000mL6、洗涤液（0.05%Tween-20的PBS（pH7.4））：8.0gNaCl，0.2gKCl，2.9gNa2HPO4·12H2O，0.2gKH2PO4，

5、0.5mL吐温-20（Tween-20），加ddH2O至1000mL。7、保温液（含0.1%BSA的洗涤液）：0.1g牛血清白蛋白（BSA），洗涤液100mL48、底物液（TMB-H2O2）：磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液（pH5.0）：25.7mL0.2mol/LNa2HPO4，24.3mL0.1mol/L柠檬酸液，加50mLddH2O。TMB母液：0.2gTMB干粉溶于100mL无水乙醇中配制而成。底物液（TMB）：新鲜配制。TMB母液用底物缓冲液按1∶20的比例稀释，每毫升底物液加入0.2μL30%H2O2。9、终止液：0.25%氢氟酸四、实验方法与步骤（一）试剂配制1、包被液（0.025mol

6、/LpH9.6碳酸盐缓冲液）：1.59gNaCO3，2.93gNaHCO3，加ddH2O至1000mL2、洗涤液（0.05%Tween-20的PBS（pH7.4）：8.0gNaCl，0.2gKCl，2.9gNa2HPO4·12H2O，0.2gKH2PO4，0.5mL吐温-20（Tween-20），加ddH2O至1000mL。3、保温液（含0.1%BSA的洗涤液）：0.1g牛血清白蛋白（BSA），洗涤液100mL。4、底物液（TMB-H2O2）：磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液（pH5.0）：25.7mL0.2mol/LNa2HPO4，24.3mL0.1mol/L柠檬酸液，加50mLddH2O。TMB母液

7、：0.2gTMB干粉溶于100mL无水乙醇中配制而成。底物液（TMB）：新鲜配制。TMB母液用底物缓冲液按1∶20的比例稀释，每毫升底物液加入0.2μL30%H2O2。5、终止液：0.25%氢氟酸（二）实验步骤1、取已包被伪狂犬病毒抗原的酶标板（根据样品多少，可拆开分次使用），用样品稀释液（PBS）将待检样品1∶40稀释后加入板孔中，每孔加100μl。同样1∶40稀释阴、阳性对照血清，阴、阳性对照