酶联免疫吸附试验.pdf

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1、酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)的基本原理方法类型及反应原理、、、试剂制备、试剂制备和和和临床意义酶免疫技术是三大经典标记免疫技术之一，是以酶标记抗体或抗原为主要试剂的一种标记免疫分析技术。随着相关新技术的不断问世，如杂交瘤单克隆抗体技术（使各种对抗原决定簇高度特异的单克隆抗体可以在体外批量生产）、生物素－亲和素放大系统的应用以及与化学发光和电化学发光技术的偶联等，明显地提高民分析和测定方法的特异性、灵敏度及其自动化程度，使酶免疫技术不断更新，应用范围不断拓宽。当前，酶免疫技术已与形式各异、各具特点和用

2、途的定位、定量和超微量测定的标记免疫分析技术融合发展，在医学和生物学中的应用日益广泛，是取代放射免疫技术的主要方法之一。酶免疫技术的特点酶免疫技术是以酶标记抗原或酶标记抗体为主要试剂，通过复合物中的酶催化底物呈色而对被测物进行定性或定量的标记免疫技术。基本原理是：将酶与试剂抗原或抗体用交联剂结合起来，此种酶标记抗原或抗体与标本中相应抗体或抗原发生特异反应，并牢固结合，在加入相应的酶的底物时，底物被酶催化生成呈色产物，在免疫组化染色时可指示待测反应物的存在和定位，在酶免疫测定中，则可根据呈色物的有无和呈色深浅作定性或定量观察。由于此技术是建立在抗原抗体反应和酶的高

3、效催化作用的基础上，故而该技术具有检测灵敏度高、特异性强、准确性好等特点，而且，可与其他技术偶联而衍生出适用范围更广的新方法。①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某重酶连接成酶标抗原或抗体，且既保留其免疫活性又保留酶的活性。③标本中的抗原或抗体、标记抗原或抗体能按一定的次序与固相载体表面的抗体或抗原反应，并通过底物与酶的反应来反映标本中的抗原或抗体的量。酶免疫技术的分类：：：一一一、一、、、按检测对象的不同一般分为两类按检测对象的不同一般分为两类：：：1.酶免疫组织化学技术（enzymeimmunohistochemistry

4、,EIH）:用于检测组织切片或细胞涂片中的抗原或抗体。2.酶免疫测定技术(enzymeimmunoassay,EIA):用于检测体液样本中可溶性抗原或抗体。二二二、二、、、根据抗原抗体反应后是否需要分离结合的和游离的酶标记物根据抗原抗体反应后是否需要分离结合的和游离的酶标记物，，，可分为，可分为：：：1.均相法（homogenous）：不需要分离结合和游离的酶标记物，直接进行测定。2.异相法(heterogenous)：需要分离结合和游离的酶标记物后才能进行测定。酶免疫组化酶免疫技术均相酶免疫测定酶免疫测固相酶免疫测定定异相酶免疫测定液相酶免疫测定必备试剂：：：

5、①固相抗原或抗体------免疫吸附剂②酶标记的抗原或抗体------酶结合物③酶反应的底物------底物酶联试剂阳性对照酶标记物显色液A终止液反应板显色液B浓缩洗涤液加样枪与吸头阴性对照双抗体夹心法，属于非竞争结合测定。它是检测抗原最常用的ELISA，适用于检测分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测。工作原理是：利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。由于反应系统中固相抗体和酶标抗体的量相对于待测抗原是过量的,因此复合物的形成量与待测抗原的含量成

6、正比(在方法可检测范围内)。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量(OD值)，即可确定待测抗原含量。若固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个不同的抗原决定簇结合，则属于双位点夹心法。若采用固相载体上的抗原和酶标抗原分别与样品中被检测抗体分子结合，则是双抗原夹心法。【操作步骤】双抗原夹心法，属于非竞争结合测定。它是检测抗体的ELISA。工作原理是：利用连接于固相载体上的抗原和酶标抗原分别与样品中被检测抗体分子上两个抗原结合位点结合，形成固相抗原-抗体-酶标抗原免疫复合物。由于反应系统中固相抗原和酶标抗原的量相对于待测抗体是过量的,因

7、此复合物的形成量与待测抗体的含量成正比(在方法可检测范围内)。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量(OD值)，即可确定待测抗体含量。若采用固相载体上的抗原和酶标抗原分别与样品中被检测抗体分子结合，则是双抗原夹心法。双抗原夹心法-操作步骤：：：⑴将特异性抗原包被固相载体。孵育一定时间，使形成固相抗原，洗涤除去未结合的抗原和杂质。⑵加待检标本，孵育，使标本中的抗体与固相载体上的抗原充分反应，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。⑶加酶标抗原，孵育，使形成固相抗原-待测抗体-酶标抗原夹心复合物。洗涤除去未结合酶标抗原。⑷加底物显色。固相上的酶催

8、化底物产生有色产物,通过