酶联免疫吸附试验测AFP――ELISA双抗体夹心法.ppt

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1、ELISA综合性实验二综合性实验设计方案探讨ELISA最佳工作浓度的选择——此次试验提供0.5mg/mL的包被抗体原液每组300μl(经过一系列的预实验，现在我们抗体包被的浓度范围缩小为10μg/mL～60μg/mL)。——包被用Na2CO3缓冲液每组各10ml——酶标抗体稀释液、抗原稀释液每组10ml——1:50酶标抗体液每组100μl（预实验后工作浓度范围缩小在1:2000～1:10000之内）——800μg/mL的检测抗原原液每组800μl（自己调整检测浓度，此次试验强阳性抗原为400μg/mL、弱阳性抗原浓度为20μg/mL、阴性直接加抗原稀释液）——聚苯乙烯酶标板条3条，共36

2、孔实验设计操作要求包被抗体、酶标抗体、检测抗原浓度的确立；聚苯乙烯板条每孔加包被抗体液100μL，4℃包被48h。弃去孔内液体，每孔加200μL封闭液，4℃封闭24h。弃去封闭液，风干，检测（检测时每孔所加的各稀释度的酶标液和抗原都为100μL），结果分析。标本检测的原理将特异性抗体包被固相载体，加入受检标本（抗原）使之与固相载体上的抗体结合成抗体抗原复合物，加入酶标抗体形成抗体抗原酶标抗体复合物，加入底物显色。实验材料与仪器待检抗原原液、酶标抗体、抗原稀释液、酶标稀释液、酶标板条、洗涤液、显色液A、显色液B、终止液滴管、吸管、微量加样器、移液管酶标仪、温育箱操作在酶标板条的孔中加入相应

3、浓度的抗原（100UL/孔）↓37℃×30min弃孔内液体，用洗涤液洗3遍，30s/次↓拍干加所设计的不同工作浓度的酶标抗体100UL/孔↓37℃×30min弃去孔内液体，同上洗涤三次↓拍干加底物A、B液各2滴(100UL/孔)↓37℃×15min显色后加终止液1滴(50UL/孔)↓酶标比色仪450nm读取OD值棋盘滴定法选择最佳工作浓度选择标准：强阳性参考血清A值为0.8左右阴性参考血清A值<0.1（即：选择强阳性对照孔最接近0.8，且阴性孔小于0.1的孔所对应的包被浓度和酶标浓度为最佳的ELISA检测浓度。）实验设计要求在实验本上绘出36孔设计图表写出实验中选择的包被液的情况写出实验

4、中选择的包被抗体、酶标抗体、检测抗原的浓度，和系列稀释方案。写出最终测得的OD值并分析实验结果。123456789101112评价双抗体夹心ELISA法简单易行，不需复杂的仪器设备，特异性强、敏感性高，其中一步法更简单、省时，但有Hook效应的缺点。Ab＋Ag＋Ab*AbAgAb*＋AbAg＋AgAb*＋Ab*AgAb*abcdAb＋AgAbAg（b复合物）(1)AbAg＋Ab*AbAgAb*（a复合物）(2)HooK‘S效应（钩状效应）ELISA影响因素实验设计第一组：边缘效应第二组：叠加效应第三组：温浴方式第四组：加样方式第五组：洗涤次数第六组：温浴时间第七

5、组：试剂温度小组讨论结束后每组写出一份具体的试验设计方案，下节课上每组派代表上台讲述实验方案和可行性，讲述时间为2-3分钟左右。要求设计方案中包括：实验对象、标本要求操作条件、操作过程（可画出96孔加样示意图或对比示意图等）结果判断标准结果分析方式谢谢！