资源描述：
《耐热中性蛋白酶产生条件及酶的亲和层析纯化》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、微生物学报34(4):285一292,1994ActaicologiS动iMrobicaca耐热中性蛋’白酶产生条件及酶的亲和层析纯化金城杨寿钧刘宏迪张树政(中国科学院微生物研究所北京1。。080).一,摘要从云南西双版纳分离的耐热菌株中筛选到菌号为HY69的菌株经鉴定为嗜热脂肪芽饱杆菌Bstthlus)。。(acilusearoermoP爪该菌产中性蛋白酶对该菌株的产酶条件进行了研究,酶的产量和耐热性均优于其它菌株。发酵液经超滤浓缩、硫酸按沉淀后以亲和层析纯化。Cbz一L一phe一一sepharose4Bz一
2、一phe一一sepharose4B,粗酶分别以T和CbDT纯化并对两种材料的,AGEDs一PAGE。纯化效果进行了比较得到了P和S均一的酶关键词嗜热脂肪,,芽抱杆菌耐热中性蛋白酶亲和层析耐热蛋白酶被广泛应用于皮毛、食品、酿造和医药等工业中,是一种应用广泛的工业酶制剂[lj。近年来耐热蛋白酶引起了研究者的关注,其显著的耐热性为蛋白酶的应用提供了一个很有希望的前景。这方面的研究的进行,不仅具有应用价值,而且对从理论上阐明酶的耐热机制具有现实意义。,多种耐热菌产生的耐热蛋白酶已有报道其中最著名的是由Bacilusee
3、oeuserosn仁2‘〕,eru:一aosn[5〕;thrmoprotlyti产生的Thmlyi和由ThmT551产生的eldlyi·。Bacillussteahehilus[6’〕由rotoOP产生的耐热中性蛋白酶亦已见报道,我们从云南西双版纳的温泉群中分离了220株耐热菌并从中筛选到一株产耐热中一,Bacil“、:tearothelu:)HY69性蛋白酶的菌株嗜热脂肪芽抱杆菌(rmoPhi对其产酶条件进,;而且行了研究以两种不同的亲和层析材料对该酶进行了纯化并对它们的纯化效果作了比较。材料和方法1.1仪器
4、和试剂..一一一,一一-111:aroenxyLphenyaaninerieroenzoxyD试剂NCbb扔ll(Aldh公司)NCabb,·phenyl“lanine(Sigma司)CNBr活化的Sepharose4B(pharmacia公司)碳化二亚胺今,,一,。(Sigma公司)NN二甲基甲酞胺(Fluka公司)三亚乙基四胺(Fluka公司).,J,:1LZ仪器高温摇床(NBS公司)层析紫外检测记录仪(IKB公司)721型分光光度计。LZ培养墓及培养条件..,.,.,.,.12.1PYG:培养基(%)蛋白
5、陈05酵母浸膏03葡萄糖01氯化钠02pH7o一本课题由国家自然科学基金资助。。本文于1993年1月19日收到··34286微生物学报卷7.2。..。1:22PYG斜面在PYG培养基中加入2%琼脂粉..:.,..,,123PYM蛋白脉0101,00105培养基(叱)酵母浸膏硫酸镁氯化钙.0氯化钠.,.,;。001琼脂粉2pH72灭菌后加入无菌脱脂牛奶3%(V/V)1.2.4产酶培养基:0.2,0.3,0.1,0.1,(%)硫酸按酵母浸膏葡萄糖氯化钠硫酸镁.,..,.,...。0050005,000500102,
6、pH7o一75氯化锌氯化锰酪素氯化钙..一:1:,培养条件将HY69的PYG斜面菌种接种于PYG培养基中(4oml/25oml三角,,,瓶)60℃静止培养12小时以10%接种量接入400ml产酶培养基中(Zoooml三角瓶)’‘65℃(25orn)培养,46;400orn20于/mi24小时然后于室温静置一小时/mi离心分钟,。(4℃)上清液于4℃保存备用;在此条件下酶产量达14400U/g湿菌体1.3菌株,,从云南西双版纳的温泉中采样103个以PYG培养基70℃培养24一48小时富集PYG℃培),0,P然后在
7、平板上分离单菌落(60养24小时共分离了2株菌接种于YG斜,,;面并冻干保存斜面菌种接种于PYM平板60℃培养24一48小时后挑选出能分解牛奶而产生透明圈的菌株。HY一69菌株在,菌号为PYM平板上可产生较大的透明圈经鉴定一acussteaeus。HY69为嗜热脂肪芽抱杆菌(丑illrothoOPhil)1.4酶活力测定0.sml0.6%酪素(pH7.5)于805,将℃水浴中保温分钟然后加人以蒸馏水作适当稀释之酶液0.5ml,反应10分钟,以lml0.4mol/L三氯;lml上乙酸终止反应离心后取清液于新管中,
8、加入5ml0.4mol/L碳酸钠和0.sml福林一酚工作液,于40℃保温发色20,。,。分钟用721分光光度计测定680nm吸光度对照在反应前加三氯乙酸其余条件相同,。在上述条件下每分钟水解酪素释放1拜g酪氨酸的酶量定为一个酶活单位1.5蛋白质测定ory8raor。。用Lw法{〕;1一100拜g蛋白按Bdfd法测定[川均以牛血清白蛋白作标准.一一16CbzLphe一一sepharose
