细胞色素C氧化酶的表达、纯化及其活性测定

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1、学校代号：10532学号：S0911W102密级：湖南大学硕士学位论文细胞色素C氧化酶的表达、纯化及活性测定苴，、ExI，Puriticationand。gtheactivityofCytochromexpresslonurltlCationandmeasurlntheactlvlty01：ytoctlrome，gOxidaseCfromA．ferrooxidansbyQINFangB．E．(JishouNormalUniversity)2005AThesissubmittedinpartialsatisfactionoftheRequirementsforthed

2、egreeofMasterofSciencelnChemicalengineeringintheGraduateSchoolofHunanUniversityProfessorHEYanSeniorEngineerSHENJianFengAssociateprofessorZENGJiaJune，2011湖南大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意

3、识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：鳓日期：刎年6月，日’学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于1、保密口，在——年解密后适用本授权书。2、不保密口√(请在以上相应方框内打“4")作者签名：导师签名：舜易1日期：锣：WI1年渺1年6月弓日占月弓日，细胞色素c氧化酶的纯化、表达及其活性测定摘要细胞色素C

4、氧化酶(常用名为CO，CcO，COX或者复合体IV)是含血红素／铜终端氧化酶大家族的成员之一。它是所有原核和一些真核生物电子传递链上的终端金属膜蛋白酶，它不但起着催化02还原为H20的4电子反应，而且承担着质子跨过线粒体内膜的功能。参与氧化还原反应：02(gas)+4CytC2+(aq)+4H30+(aq)一4CytC"(aq)+6H20(aq)，产能220kJ／mol(pH=7)。每个02分子消耗8个内膜质子，其中4个质子用于生成水，另外4个质子泵出膜外。该酶是一个复合的膜蛋白，通常以二聚体的形式出现，包括多个亚基及不同的金属活性中心。真核生物线粒体的细胞色素C氧

5、化酶一般含有11．13个亚基，而原核生物含有的亚基数量相对较少，一般含有四个亚基。亚基I和亚基II是各种呼吸链终端酶的高度保守的结构，也是功能酶的核心结构。该结构参与催化02的还原和质子泵的作用。亚基II上含有能从还原性细胞色素c获得电子、水溶性的双核铜蛋白中心即CuA中心，亚基l上含有一个低自旋的亚铁血红素a即hemea、高自旋的亚铁血红素a3即hemea3和铜金属催化中心即CuB中心，后两者组成一个双核金属活性中心。细胞色素c氧化酶电子传递途径：细胞色素c_血红素a_CuA中心一血红素a3-CuB中心一02。它在电子传递的同时耦合质子的传递，并且产生维持正常生命

6、活动所需的ATP。Acidithiobacillusferrooxidans阻．ferrooxidans)是化能自养型细菌，通过氧化亚铁离子变成铁离子并把电子最终受体02还原成水，从而获取能量。它的细胞色素c氧化酶属于aa3型酶。该酶的核心结构由线粒体基因编码并定位合成并具有酶催化活性，依次分别为：亚基I(CoxA)、亚基II(CoxB)和亚基III(CoxC)，其余的由核基因编码，前两个是该酶的核心亚基。亚基I是细胞色素c氧化酶最大的一个亚基，是一种完整的疏水膜蛋白并带有十二个跨膜螺旋(I～XII)结构，含有其中三个氧化还原反应中心：辅基CuB、hemea和hem

7、ea3。亚基II含有CuA中心。由此可见，该细胞色素C氧化酶也含有四个氧化还原中心，CoxA在电子和质子的传递过程中起着重要的作用。本论文通过聚合酶链从A．ferrooxidans中克隆出CoxA基因，用琼脂糖凝胶电泳检测和分离目的片段。在原核质粒抽提、纯化、检测合格后，将目的片段和质粒分别酶切、用琼脂糖凝胶分离、用各自专用试剂盒纯化。在连接酶的作用下，将质粒和目的片段连接，获得重组质粒，然后在Escherichiacoli(E．coli)成功表达并用一步Ni”亲和层析法纯化出带有组氨酸标签的蛋白。通过紫外．可见扫描测定该蛋白具有两个特征峰；通过紫外．可见扫描测