细胞色素c的制备及测定课件

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1、细胞色素C的制备及测定一、基本原理细胞色素C的基本简介蛋白质及多肽类药物分离纯化的基本原则及注意事项1.细胞色素C的基本简介生物氧化过程中重要的电子传递体。主要存在于线粒体中，需氧多的组织含细胞色素C最多，如心肌及酵母细胞的细胞色素C含量比一般组织细胞的高。氨基酸中含有较多的精氨酸，故呈碱性，等电点pI为10.2～10.8它可分为氧化型和还原型两种，两者在水溶液中的颜色明显不同：其氧化型水溶液呈深红色，还原型水溶液呈桃红色。其中还原型较氧化型稳定。临床作用细胞色素C是一种细胞呼吸激活剂。在临床上细胞呼吸障碍引起的一系列缺氧状态，在使用细胞色素C后就可以纠

2、正其物质的代谢，使细胞恢复正常呼吸，病情得到缓解或痊愈。细胞色素C目前在临床上虽非特效药物，但可用于缺氧急救、解毒及其辅助治疗，是治疗组织缺氧及由缺氧所引起的一系列症状的重要生物药品。1.原料的选择和预处理2.原料的粉碎；3.提取，即从原料中经溶剂分离有效成分，制成粗品的工艺过程；4.纯化，即粗制品经盐析、有机溶剂沉淀、吸附、层析、透析、超离心、膜分离、结晶等步骤进行精制的工艺过程；6.成品及.制剂，即半成品或原料药经精细加工制成片剂、口服液、针剂、冻干剂等供饮用或临床应用的各种剂型。5.干燥及保存；2.蛋白质及多肽类药物分离纯化二、实验基本过程细胞色素

3、C的制备细胞色素C的含量测定细胞色素C的制备取新鲜或冰冻猪心除去脂肪和韧带用水洗去积血切成小块放入绞肉机绞碎1.材料处理每组称量碎肉xg，加自来水2xmL，搅拌用2mol/LH2SO4调pH～4.0（需不断调整）搅拌提取2h用1mol/LNH4OH调pH6.0用四层纱布挤压过滤，收集滤液，肉渣回收2.提取自来水1.5xmL;搅拌提取1h3.中和合并滤液用1mol/LNH4OH调pH7.2静置～30min，使溶液分层过滤除杂质4.吸附和洗脱每组称人造沸石11g合并清液浮选平均分成两份自来水装柱上样（1ml/min）Cyt.C吸附

4、取出浮石，放入烧杯中，依次用自来水、去离子水、0.2%NaCl、去离子水清洗装柱后用25%(NH4)2SO4洗脱（流速小于2mL/min）5.盐析收集红色洗脱液，量体积（控制在10mL左右）每100mL洗脱液加20g固体(NH4)2SO4，边加边搅拌至(NH4)2SO4完全溶解，并有沉淀析出室温静置30min滤纸过滤，收集滤液，量体积6.三氯醋酸沉淀按8%体积滴加20%TCA，边加边搅拌立即离心（3000rpm，15min）收集沉淀若上清液仍为红色，倒出后再补加5%体积的TCA，再次离心，收集沉淀Cyt.C沉淀用少量去离子水溶解（体积不超

5、过5mL）7.透析溶解液装入透析袋对自来水、去离子水透析，用Ba(Ac)2检测透析袋周围水的SO42-过滤除去不溶物,得到Cyt.C粗品液，量体积，测定其含量细胞色素C的含量测定1.已知标准细胞色素含量和对应的光密度值的标准曲线2.样品测定1ml样品￫稀释适当倍数￫加少许联二亚硫酸钠（还原剂）￫520nm处测定光密度。实验结果细胞色素C的含量(mg):3.71×OD×稀释倍数×终体积×1/4或:3.71×OD×稀释倍数×终体积×1/4×500/猪心重量（特定猪心重量中所获得的细胞色素C的量）注意事项1．尽可能除掉猪心中的韧带、脂肪和积血。2．使用离心

6、机之前，一定要配平。3．透析之前要检查透析袋。4．在520nm处测得各管的光密度时，要加少许还原剂。